Bonjour,

Je suis acutellement en stage dans un laboratoire de toxicologie cellulaire, dans lequel je test des molécules sur des cellules hépatiques : lignée HepG2, et sur des cellules neuronales non différenciées : lignée SK-N-BE(2).
Les molécules que je test seront pototiellement utilisé pour un traitement per os, c'est pourquoi je les test sur des cellules hépatiques.
Pour savoir si les molécules testées sont toxiques ou non sur mes cellules, je réalise un test MTT. Cependant je perd à chaque fois que je retire mon réactif MTT des cristaux bleus.
Mon protocole est le suivant : dans une plaque 96 puits incubé 24h pour les cellules HepG2 et 48h pour les cellules SK-N-BE(2) à l'avance (à une concentration de 60 000 cellules/puits), je retire le milieu complet (avec SVF) de mes puits puis je dépose le traitement (molécule diluée dans du milieu incomplet : sans SVF) que j'incube 4h à 37°C. Ensuite je retire mon traitement et je dépose le réactif MTT dilué dans du PBS + calcium + magnésium que j'incube 2h à 37°C, et enfin je dilue mes cristaux bleus dans du DMSO.
Avez-vous déjà travaillez sur ce type de cellules ? Avez-vous rencontrez des problèmes similaires ? Comment améliorer ce protocole ?

Je réalise également une différenciation des cellules SK-N-BE(2) : pour cela j'ensemence une plaque 48 puits à 40 000 cellules/puits dans du milieu complet avec 10% de SVF le jeudi, le vendredi je change le milieu complet + 10% SVF et j'ajoute 10 µM d'acide rétinoïque. Le lundi je remplace le milieu par du milieu complet + 1% de SVF et 10 µM d'acide rétinoïque. Et enfin le mercredi je traite mes cellules et je réalise un test MTT.
Cependant les cellules ne sont plus très belles à la fin de la différenciation, mais j'observe cependant des changements morphologiques. Et elles ont également tendance à se répartir au centre du puits, je pense que c'est pour cela qu'elles ont du mal à survivre.
Qu'en pensez-vous ? Avez-vous déjà réaliser une différenciation de ces cellules ?


En vous remerciant par avance pour votre aide !