Bonjour,

En stage de M2 microbiologie je travaille sur Adénovirus. Je cherche à quantifier l'augmentation de génome de ces derniers dans divers échantillons par qPCR en temps réel. Pour se faire, j'utilise une gamme étalon faite à partir d'un plasmide pEX-A2 avec l'insertion du gène d'intérêt.
Ce plasmide m'a été fourni par une industrie qui le synthétise in vitro.
Après dilution de la poudre fournie dans de l'eau ultra-pure, je l'ai linéarisé et quantifié à l'aide d'un nanodrop (4,6 ng/µL), la limite de détection du nanodrop étant de 2 ng/µL.
Ensuite, pour produire ma gamme étalon, j'ai calculé la concentration en nombre de copies/µL, j'obtenais environ 7 x 10^12 cg/µL puis j'ai dilué en cascade pour obtenir une gamme allant de 1 x 10^7 a 1 cg/µL. J'ai effectué une qPCR dans la foulée pour tester la gamme et je pouvais détecter les échantillons allant jusqu'à 10 cg/µL.
Ensuite j'ai congelé mes échantillons de gamme à -80°C.
La PCR suivante, je ne pouvais plus détecter 10 cg/µL.
Puis les PCR suivantes, la gamme sortaient avec des Ct très différents de la première : j'avais environ 3,5 Ct de différence de la première fois, comme si j'avais dilué 10 fois mes échantillons, or je partais des même tubes que la première gamme.
Pensant que c'était à cause de la congélation, j'ai ré-effectué une dilution de gamme que j'ai conservée à 4°C mais encore une fois même problème, la gamme se comportait comme si je l'avais diluée 10 fois plus. Après vérification sur une énième gamme rediluée j'obtiens les même chiffres.
Je duplique mes points et d'un point à l'autre, et uniquement pour la gamme, mes Ct sont très différents (mais pas pour mes échantillons, ce qui me fait dire que mes dépôts sont assez uniformes quand même alors pourquoi j'aurais des Ct différents pour la gamme?).

Mes questions sont : est ce que quelqu'un s'est déjà trouvé confronté à ce problème?
Comment se conserve un plasmide d'ADN, est ce mieux à 4°C, à -20°C? à -80°C?
Sachant que j'utilise des tubes Low Binding, est ce que le plasmide peut quand même adhérer aux tubes? aux cônes?
Est ce que la même chose se produirait avec un plasmide dupliqué et extrait d'une bactérie?
Que pourais-je faire pour amméliorer mes Ct (j'homogénéise mes tubes au vortex puis je fais des aller-retour avec la pipette avant de prélever et une fois dans le puits de la plaque je refais des aller-retour)?

Je vous remercie par avance pour vos réponses, en espérant avoir été clair.

Marie