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qPCR et quantification relative



  1. #1
    agrospe

    qPCR et quantification relative

    Bonjour

    Je dois faire une quantification relative à partir d'une qPCR faite en TP. J'ai bien compris le principe, et à priori aucun problème sauf que dans mon cours j'ai une courbe standard par gène (gène d'intérêt + gène de ménage) et moi j'en ai deux...

    Pour expliquer: nous avons 2 échantillons à comparer pour le gène NPM-ALK, on prend comme gène de ménage l'actine.
    On a fait une RT-PCR totale, puis une qPCR avec 3 dilutions au 5° (1/5, 1/25 et 1/125 de l'échantillon initial). On a donc comme données les valeurs de CT dans toutes les conditions, soit:
    -NMP-ALK 1 : 3 CT pour 1/5, 1/25 et 1/125, associé à ça 3 CT pour l'actine (même dilution car même échantillon)
    -la même chose pour l'échantillon 2

    De là, je ne vois pas du tout comment faire une seule courbe pour NPM-ALK et une seule pour l'actine...

    J'ai essayé de faire avec mes 4 courbes, mais ça me donne n'importe quoi j'ai l'impression...

    (Nos valeurs d'efficacité sont différentes dans les 4 cas, sinon c'est pas drôle ><' )

    Merci pour vos réponses, je suis perdue

    -----


  2. Publicité
  3. #2
    Loupsio

    Re : qPCR et quantification relative

    Je ne suis pas sur d'avoir bien compris le problème, mais je vais essayer ...

    tu as 3 valeurs de Ct pour l'actine (les dilutions), puis 3 valeurs de Ct pour ton gène d'intérêt? c'est bien ca?
    Et tu as fait la même chose pour l'échantillon 2? (donc tu as refais les Ct d l'actine ici aussi?)

    A partir de chaque trio de Ct (tes dilutions) tu peux calculer l'efficacité de tes amorces (ce que tu as déja fait je pense puisque tu dis qu'elles sont différentes pour les quatres)
    si tu test les mêmes couples d'amorces pour tes réplicats d'actine, tu devrait avoir des efficacités similaires, pareil pour ton gène d'intérêt (en revanche si l'efficacité que tu obtiens pour l'actine est différent de celui pour ton gène d'intérêt, c'est normal, enfin ce n'est pas un problème)

    quelle est la courbe que tu souhaite faire?
    normalement tu as déjà des courbes comme celle que j'ai mis avec ce message (sauf qu'au lieu d'avoir 6 courbes dans le premier graphe tu en as 3 et au lieu d'avoir une droite a 6 points comme dans le deuxième, tu as une droite à 3 points), vu que tu as tes Ct et que tu avais besoins de ca pour calculer ton efficacité
    graphsman1.png
    Vu que tu as ton efficacité
    Il ne te reste plus qu'a calculer ton expression relative,
    a savoir [1+E^(G0-G1)] / [1+E^(ref0-ref1)]
    en sachant que :
    1+E c'est ton efficacité (si ton efficacité est de 99% ce sera 1.99) (1E au numérateur c'est celle de ton gène d’intérêt, et 1+E au dénominateur c'est ton gène de référence)
    G0 c'est le Ct de ton gène d’intérêt de la condition 1 (ta référence)
    G1 c'est le Ct de ton gène d'intérêt de la condition 2 (dont tu veux savoir si elle va exprimer plus ou moins ce gène)
    ref0 c'est le Ct de l'actine condition 1
    ref1 c'est le Ct de l'actine condition 2

    si tu obtiens après ta division quelque chose comme 77 par exemple, cela signifie que ton gène est 77 fois plus exprimé dans ta condition 2

    (si tu veux la logique derrière cette formule n'hésite pas, je trouve que c'est mieux de comprendre pourquoi c'est ca ton efficacité relative plutôt qu'appliquer bêtement)

    Voilà, j'espère que ca répond à ta question, car je suis pas sur de l'avoir cernée, si tu as besoin de précisions, n'hésites pas.
    Dernière modification par Loupsio ; 06/04/2015 à 15h04.

  4. #3
    agrospe

    Re : qPCR et quantification relative

    Bonjour

    Le problème dans la formule que vous m'avez donné (et que je comprends bien car on l'a vu en cours) c'est qu'il faut des E égaux pour le gène en question dans les 2 échantillons, ce qui n'est pas mon cas.

    Et d'après mon cours, on fait une droite standard pour chaque gène (grâce aux dilutions donc) et ensuite on prend le CT de chaque condition pour voir le N0 relatif, que l'on normalise grâce à l'actine. Mais pour ça, il faut n'avoir qu'une seule droite pour chaque gène, et j'en ai 2...

    J'ai "testé" en appliquant la formule (1+E1)^CT1/(1+E2)^CT2 (que j'ai d'ailleurs retournée dans tous les sens) et pas moyen de trouver ce qu'il faut :/ En tout cas j'ai l'impression que ça ne va vraiment pas...

    Je ne sais pas comment être plus claire (et je sais que ce n'est pas facile à comprendre^^) peut-être en mettant ce que j'ai fait ??


    Merci


    PS : par ailleurs, je n'ai aucune idée d'à partir de quelle valeur d'expression ça devient aberrant -_-
    Dernière modification par agrospe ; 06/04/2015 à 15h56.

  5. #4
    Loupsio

    Re : qPCR et quantification relative

    oui il te faut des efficacités équivalentes (pour un couple donné, pas entre les différents couples pour les différents gènes), dans l'idéal 1+E =2 car E=1 (100%) ce qui singifierai que a chaque cycle tu as deux fois plus d'amplicons, si au cycle 1 tu as un amplicon, a la fin tu te retrouve avec deux amplicons, qui vont eux même être doublés au cycle suivant ce qui t'en feras 4 puis 8 etc...
    cependant ceci dépend de tes amorces, si tes amorces marchent mal, tu ne vas pas vraiment doubler ton nombre d'amplicon a chaque cycle ,
    c'est pur ca que tu peux avoir une efficacité de 98% ou 102%... cependant vu que ca représente l'efficacité de ton couple d'amorce, si tu utilise les mêmes amorces sur le même matériel génétique, elles sont censés fonctionner de la même manière (aussi bien si elles marchaient bien, ou aussi mal si elles marchaient mal) c'est pour cela que ton efficacité des amorces pour un couple donné est censé être la même, sinon c'est qu'il y a un problème au niveau de la manipulation, ou autre, à toi de déterminer d’où peux venir le problème,

    dans ta formule : (1+E1)^CT1/(1+E2)^CT2
    que représente Ct1 et Ct2? ce sont biend des différences de Ct et non pas des Ct eux mêmes?


    Mais pour ça, il faut n'avoir qu'une seule droite pour chaque gène, et j'en ai 2
    si tu as deux droites c'est que tu as deux réplicats, a ce moment la, si les valeurs sont proches entre tes deux réplicats, tu peux faire une moyenne a partir de chaque valeur de dilution et faire ta droite a partir des dilutions moyennes (si en revanche il y a des différences trop importantes entre tes deux réplicats, il vaut mieux faire les calculs deux fois a partir des deux efficacités différentes que tu auras trouvés grâce a tes deux droites différentes)

    SI tu pouvais mettre quelques exemples, ce serai en effet peut être plus facile de t'aider effectivement
    Dernière modification par Loupsio ; 06/04/2015 à 16h34.

  6. #5
    agrospe

    Re : qPCR et quantification relative

    Alors voilà mes valeurs, et le dernier truc que j'ai bidouillé.

    Donc on a plusieurs "colonnes" faites par des binômes différents (d'où, je suppose, les différences d'efficacité), pour faire la q-PCR de l'actine 1 & 2 et du gène d'intérêt (j'ai noté ADN) 1 & 2.

    J'ai fait mes droites, ce qui m'a permis de calculer l'efficacité "moyenne".

    J'ai pris la formule Nt = N0(1+E)^CT

    Donc au moment du CT on a Nt1=Nt2 pour chaque gène, à partir de quoi on obtient:
    Nt2/Nt1 = ( (1+E1)^CT1 ) / ( (1+E2)^CT2 )
    (j'ai pris le CT moyen pour la dilution 1/25 pour tous)
    (ici, je donne l'exemple du gène d'intérêt, mais c'est la même chose pour l'actine)
    (j'ai testé aussi avec Ntactine/NT1, j'ai le même problème... en fait, j'ai tourné cette formule dans tous les sens possibles je crois:/)

    Et là, quand je fais mes calculs ça fait des trucs bizarres. Pour moi, mes valeurs sont clairement fausses, mais je ne comprends pas pourquoi...

    Je ne peux pas faire une courbe moyenne pour le gène d'intérêt, car ils provienne de 2 échantillons différents, et on veut déterminer lequel a la lus forte expression du gène.

    Je trouve aussi que mes valeurs de "Nt" sont énormes, là aussi je comprends pas.

    Je sais aussi que l'échantillon 2 doit être plus important que le 1 car on a fait une quantif absolue, et en plus ici on voit que les CT sont plus faibles

    Merci merci de m'aider
    Fichiers attachés Fichiers attachés

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    Loupsio

    Re : qPCR et quantification relative

    J'ai pas refait les calculs, j'ai repris directement tes résultats, donc a partir de :
    Ct
    actine 1 : 25.35
    actine 2 : 25.66

    ADN 1 : 28.84
    ADN 2 : 25.54

    Actine
    1+E = 1.7099
    1+E = 2.074 --> 0.364 d'écart
    Gene d'interet
    1+E = 1.972
    1+E = 1.893 --> 0.079 d'écart (moyenne = 1.9325)



    On voit que tes Ct d'actine sont relativement proches ce qui est bon puisque c'est ton gene de reference, il semble avoir un niveau de transcription équivalent dans les deux conditions et ne pas bouger des masses (bien que je crois qu'en pratique il faudrai qu'ils soient encore plus proche car il y a 0.3 Ct d'écart et je crois que c'est 0.1 pour une manip acceptable, mais à vérifier...)

    tu as des valeurs de 1+E relativement différentes effectivement, surtout pour l'actine
    pour ton gene d'interet tu as une efficacité de 1.972 et une autre de 1.893, ce qui fait 0.079 d'écart, c'est déja beaucoup et normalement tu ne fais pas de moyenne avec ca, mais étant donné que c'est pire pour l'actine tu peux tenter voir ce que ca donne déja (sinon tu fais deux fois les calculs, une fois avec 1.972 et une fois avec 1.893)
    la moyenne te donne 1.9325

    on calcule l'expression relative pour chacune des valeur d'efficacité de l'actine (vu qu'elles sont éloignés c'est mieux de faire deux fois que une seule fois avec la moyenne des deux)

    essai avec efficacité actine 1
    1.9325^(28.84-25.54)/1.7099^(25.35-25.66)
    = 10.38
    ton gene dans ta condition 2 est 10.4 fois plus exprimé que dans ta condition 1


    essai avec efficacité actine 2
    1.9325^(28.84-25.54)/2.074^(25.35-25.66)
    =11.025

    finalement les résultats sont assez proches,(en supposant que ton actine soit au meme niveau de transcription dans tes deux condition, ce qui est censé être le cas) alors dans ta condition 2 tes cellules fabriquent 10 à 11 fois pluss de ton gène d'intéret que dans ta condition 1

    Les résultats ne paraissent pas si aberrant que ca en tout cas,
    Dernière modification par Loupsio ; 06/04/2015 à 17h51.

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  10. #7
    agrospe

    Re : qPCR et quantification relative

    Je vais prendre ta solution en faisant une moyenne des efficacités pour le gène d'intérêt et l'actine, je pense que ce sera plus simple

    Par contre, je ne comprends toujours pas pourquoi mes calculs sont faux, mais bon tant pis^^

    En tout cas merci pour ton aide, surtout pour un lundi férié

  11. #8
    Loupsio

    Re : qPCR et quantification relative

    Je vais prendre ta solution en faisant une moyenne des efficacités pour le gène d'intérêt et l'actine
    Hum a ta place je ferais l'actine en deux fois (comme j'ai fait plus haut) et ensuite faire une moyenne des résultats 10.38 et 11.05 ce qui fait 10.715, plutôt que faire le calcul d'expression relative directement avec la moyenne de l'actine, ca montre que tu vérifie quand même si la différence engendrée n'est pas énorme, ce qui pourrait l’être)

    Tes calculs ne sont pas vraiment faux puisque j'ai utilisé tes calculs (efficacité, moyennes de Ct utilisés...), je pense que si tu ne retrouve pas la même expression relative cela vient de ton application e la formule générale :
    Nt2/Nt1 = ( (1+E1)^CT1 ) / ( (1+E2)^CT2 )
    es-tu bien sur que dans ta formule "CT1" et "CT2" représentent bien une différence de Ct? car tu dis que tu prend les moyennes, mais c'est bien la différence entre les moyenne des deux conditions pour chaque gène que tu utilise ici?
    je pense que ca viens de la car j'ai utilisé les même valeurs que toi, (j'ai repris ton tableau récapitulatif en bas dans ton pdf) et mis a part cette différence de soustraction il s'agit bien de la même formule

    En tout cas bonne chance pour la suite
    Dernière modification par Loupsio ; 06/04/2015 à 18h33.

  12. #9
    agrospe

    Re : qPCR et quantification relative

    Non pour le coup, CT1 et CT2 correspondaient à des valeurs de CT (c'est la formule à l'origine de celle avec les delta CT que j'ai "séparé" en deux pour que ce soit plus lisible)
    Et c'est à partir de là que ça devient du grand n'importe quoi, je pense que je demanderai au prof après avoir rendu le CR.

    Parce que, théoriquement on a (N01/N0a1) / (N02/N0a2), et j'ai décomposé en deux fractions pour simplifier mon calcul sur excel.

    Tu as raison pour l'actine, même si je trouve aussi 10,7 avec la moyenne, au moins le prof sera content puisqu'on voit qu'il y a peu de différence

    Bref, encore mille fois merci, j'étais au bord du désespoir ^^

  13. #10
    Loupsio

    Re : qPCR et quantification relative

    Non pour le coup, CT1 et CT2 correspondaient à des valeurs de CT
    Je pense que ton erreur viens de la

    Parce que, théoriquement on a (N01/N0a1) / (N02/N0a2),
    SI tu les appelles ainsi, alors théoriquement tu as :
    {1+E^(N01)/1+E^(N0a1)} / {1+E^(N02)/1+E^(N0a2)}
    si tu décompose, tu a alors :
    1+E^(N01)/1+E^(N0a1) au numerateur
    et 1+E^(N02)/1+E^(N0a2) au denominateur

    si on utilise les vieilles regles de lycées concernant les puissances, A^b / A^c = A^(b-c)
    vu que tes deux 1+E au numerateur sont les memes et que tes deux 1+E au denominateur sont les memes tu peux passer de
    1+E^(N01)/1+E^(N0a1) au numérateur à : 1+E^{(N01)-(N0a1)}

    et de 1+E^(N02)/1+E^(N0a2) au dénominateur à 1+E^{(N02)-(N0a2)}

    et lorsque tu fais la division du numérateur par le dénominateur ca reviens a la formule que j'ai utilisée plus haut, a savoir :
    [ 1+E^{(N01)-(N0a1)} / 1+E^{(N02)-(N0a2)} ]

    Reréfléchis y à tête reposée, et en repossant vraiment les division (parce que a l'ecran c'est chaud niveau présentation ) et je pense que ca devrait etre bon
    Dernière modification par Loupsio ; 06/04/2015 à 20h56.

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