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Concentration ADN plus élevé au picogreen qu'aux UV (spectrométrie)



  1. #1
    Shivasnt

    Concentration ADN plus élevé au picogreen qu'aux UV (spectrométrie)

    Bonjour,

    Je suis très embêtée en ce moment!

    J'ai fait plusieurs quantifications d'ADN et voilà que la concentration de mes échantillons est plus élevée au picogreen qu'aux UV. Voici comment je procède.
    Ce sont des échantillons d'ADN humain provenant de Buffy Coat (couche de cellules blanches du sang). Je prends 4 ul d'ADN que je dilue dans 196 ul de TE 1X (donc une dilution 1:50). Je lis ensuite la plaque dans le lecteur absorbance (UV) ce qui me permet de déterminer la concentration ainsi que la pureté.

    Par la suite, je prend 2 ul de cet ADN dilué que je met dans un plaque noire et j'y ajoute 198ul d'une solution de picogreen 1X (au départ le picogreen est 200X, je prépare donc une solution 1X avec du TE 1X).

    Après une période de "shake" et ensuite d'attente d'environ 5 minutes je procède à la lecture de la fluorescence.
    Mes standards sont les suivants:
    100ng/ul - 50ng/ul - 25ng/ul - 12,5ng/ul - 6,25ng/ul - 3,125ng/ul - 1,5625ng/ul + blank

    Lorsque je compare les concentration de mes ADNs mesurées avec les deux technologies, alors qu'on devrait s'attendre à avoir une concentration plus élevée avec le UV c'est plutôt le contraire qui se produit et ce avec tous les échantillons (peu importe la provenance du client) que j'analyse.

    Auriez-vous une idée de ce qui pourrait causer ceci?


    Voici quelques exemples de résultats:

    ADN 1 :
    UV- 321,33 ng/ul Pureté : 1,89
    Picogreen : 365.06 ng/ul

    ADN 2 :
    UV- 266,47 ng/ul Pureté : 1,88
    Picogreen: 340.09 ng/ul

    ADN 3 :
    UV- 282,37 ng/ul Pureté : 1,99
    Picogreen: 333.82 ng/ul (CV=0.42%)

    ADN 4 :
    UV- 143,19 ng/ul Pureté : 1,98
    Picogreen : 195.4 ng/ul (CV=17%)

    Un gros merci à l'avance de votre aide!!!!!

    -----


  2. #2
    Flyingbike

    Re : Concentration ADN plus élevé au picogreen qu'aux UV (spectrométrie)

    peut être une contamination aux ARN ou autres simple brins qui seraient détectée aux UV et pas au picogreen ?

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