blunt-end ligation

[invitee170a0e7]

Bonjour à tous,
aujourd'hui je reprends le travail d'un postdoc sortant... et visiblement, on n'a pas les même méthodes .
Perso je suis un fervent des ligations/clonages cohésifs. Lui c'est plutôt blunt... Du coup je me pose quelques questions sur cette méthode dont j'ai de vieux souvenirs de cours mais 0 pratique...

Je dois réaliser un clonage assez classique. J'ai mon insert amplifié via la Phusion (et les amorces ne comportent pas d'ajouts d'enz de restriction en 5', c'est juste pile le gène d'intéret qui était dans un autre plasmide). J'ai mon vecteur de destination... il a un MCS, et j'ai repéré une enzyme qui coupe en "blunt" (hinc2). Donc je suppose que je peux linéariser mon plasmide avec cette enzyme ?

Autre point, comment se passe l'étape de ligation... ? C'est juste mon insert purifié + plasmid linéarisé + T4 ligase ?
Est-ce que je dois déphosphoriler mon plasmide ? Un traitement spéciale pour mon insert ? (a priori avec la Phusion, vu que c'est une proofreading, rien à faire de plus non?).

Merci d'avance pour vos conseils et suggestions !
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[Flyingbike]

Il vaut mieux déphosphoryler le vecteur parce qu'une ligation intramoléculaire est énormément plus probable qu'une ligation intermoléculaire. Il faudra bien entendu vérifier l'orientation de l'insert dans le vecteur (PCR ou digestion, pour cela il faut un site extérieur et un site intérieur a l'insert mais qui ne soit pas au milieu !)

[vinssss]

Bonjour,

J'ai déjà pratiqué et ça fonctionne bien mais un produit PCR n'est pas phosphorylé. Il faut donc déphosphoryler le vecteur et phosphoryler l'insert. Et bien sûr vérifier le sens d'insertion...

[invitee170a0e7]

ok merci pour vos réponses

donc si j'ai bien compris, il me faut :
Mon insert purifié et phosphorylé (comment ? par T4 DNA polymerase ?)
Mon vecteur linéarisé par mon enzyme qui blunt dans le MCS, purifié et déphosphorylé

puis c'est classique ?
T4 ligase et envoyé c'est pesé

[A voir en vidéo sur Futura]

[vinssss]

PNK (poly nucléotides kinase) pour phosphoryler l'insert. Phosphatase alkaline pour déphosphoryler le vecteur. Ligase pour liguer

[invitee170a0e7]

oops oui pour la PNK ! vu que mon insert est deja blunt à cause de la proofreading

Merci pour la précision