PCR récalcitrante

[invite8d3fede1]

Bonjour à tous,

voilà je suis étudiant en M1 et j'effectue un stage en labo. J'essaie d'amplifier un gène (TBX3) de 2171 pb par PCR, la matrice est un plasmide de 8200 pb en comptant le gène (pT-Rex-DEST30). Je compte récupérer le produit de PCR pour clonage dans un autre vecteur.
Pour l'instant je bosse avec la Dream Taq DNA pol (mise au point de la PCR avant utilisation de la Phusion) en suivant le protocole du fabricant Thermo Scientific (mais en faisant mon mix, je n'ai pas le master mix de Thermo Sc.).

1) Voilà le mix pour un point :
- Dream Taq Buf. 10X 2,5 µL
- dNTP 0.5 µL (0.2 mM final pour chaque)
- DNA pol 0.125 µL (0.625 U)
- primer For/Rev 0.625 µL (250 nM chacun)
- matrice 2.5 µL (100 ng) (Thermo dit de ne pas dépasser 1 ng)
- eau qualité BM qsp. 25 µL

2)La PCR : 5 cycles à 60°C, 35 cycles à 65°C selon les recommandations du fabricant

3) Mes amorces :
- For = ACGGTACC.ATG.AGC.CTC.TCC.ATG.AGA.GA (avec site KPN1) Tm = 60-65°C
- Rev = ACGGATCC.CTA.CGG.GGA.CGC.GCT (avec site BamH1) Tm = 65-70°C (selon les sources)

Mon problème (évident si il en est) ça marche pas !!!

J'ai fait varier:
- l' annealing de 50 à 70°C
- la concentration en MgCl2 (2 mM dans le Dream Taq buf. 1X à 3, 4,5 et 6 mM)

Après migration en gel agarose 1% j'ai pas mal de bandes aspécifiques (rien dans les contrôles).

Hier j'ai eu mon premier résultat à 3 mM de MgCl2, 60-65°C sur 40 cycles et 100 ng de matrice mais plus rien aujourd'hui.
A noter que l'augmentation de MgCl2 réduit pas mal l'intensité des bandes aspécifiques (bizarre nan ? c'est un peu l'inverse de la théorie)


Pour la petite histoire, je compte à terme (si la PCR marche haha !) cloner TBX3 dans un pcDNA3 puis le transfecter dans des cellules SiHa afin d'observer les changements éventuels sur l'expression des oncogènes E6/E7 produits par HPV16 (infectant les SiHa).

Merci d'avance pour vos précieux conseils !
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[Loupsio]

Bonsoir,

Tu as vérifié les ratio 260/280 et 260/230?

Laisse tomber le MgCl2, quand quelque chose ne marche pas, ca sert juste a se prendre la tete sur "j'en met plus? moins?" pour rien, ton buffer contiens normalement déjà du Mg (a moins qu'il y ait marqué "- Mg" sur le tube si ce n'est pas le cas, alors il y a du Mg), et la PCR doit fonctionner même si il ne s'agit pas de la quantité optimale, ce n'est qu'ensuite quand au moins tu as un produit, que tu peux essayer de faire varier le Mg pour avoir quelque chose de plus adapté et un meilleur résultat, si tu n'as vraiment rien, le problème viens d'ailleurs

Si tu as toujours le produit d'"hier" (hier est relatif selon quand tu liras ce message ) essai d'amplifier ce tube (pas celui qui t'as servi a avoir ce résultat, mais bien le tube après PCR) et fais en deux tubes a PCR, un ou tu te servira directement 2.5µL de ce produit PCR dans tes 25µL et un ou tu diluera préalablement 50x ce produit et tu te servira 2.5µL du produit PCR dilué 50x (si ta bande était bien visible tu peux même diluer a 100)

Si tu as du non spécifique tu peux augmenter un peu la température d'annealing,

et vérifie bien tes primer sur blast au préalable voir si t'as pas pris une séquence redondante pour faire tes primers

J'esère que ca pourras t'être utile

[Flyingbike]

En complément de Loupsio dont les idées sont bonnes j'ajouterai : essaie d'autres primers, ceux là ont un deltaTm peut être un peu grand
Essayez de couper votre matrice avant la PCR

Solution ultime : plutôt que de se faire chier, faites synthétiser votre brin, ça coûte maintenant bien moins cher que des dizaines de test de PCR. Vous pouvez même le faire cloner dans votre vecteur pour presque pas plus cher

[TanguyE]

Bonjour,

Quelque chose me fait tiquer dans ton message.

Pour l'instant je bosse avec la Dream Taq DNA pol (mise au point de la PCR avant utilisation de la Phusion) en suivant le protocole du fabricant Thermo Scientific (mais en faisant mon mix, je n'ai pas le master mix de Thermo Sc.).

Franchement, aucun intérêt d'optimiser avec une Taq basique si c'est pour utiliser la Phusion derrière. Si on en crois le Tm calculator de thermo, avec la dream taq j'ai ceci:

Results for Taq-based DNA Polymerases

Annealing Temperature: 50.3 °C

Primer #1
Tm 55.3°C

Primer #2
Tm 58.7°C

et pour la phusion:

Results for Phusion or Phire DNA Polymerases

Annealing Temperature: 60.9 °C

Primer #1
Tm 60.9 °C

Primer #2
Tm 63.1 °C

Etant donné que ce ne sont pas les mêmes enzymes, les mêmes conditions de réaction, je vois mal l'avantage à faire des dizaines d'optimisations pour finalement tout changer ensuite.

En règle générale, quand je fais une PCR, j'utilise toujours le Tm calculator de mon fournisseur avec la polymérase aue je compte utiliser et je suis à la lettre le protocole fourni. Ça fait quand même un bon bout de temps que j'ai eu une PCR récalcitrante (même si ça peut arriver).

Bon courage

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitec9f0f895]

Salut

Pour rebondir sur les propos de TanguyE, attention avec la dreamTAq (qui est une enzyme qui n'a pas d'activité correctrice) tu as toutes les chances de créer des erreurs dans ton fragment PCR (quand tu l'auras amplifié). Du coup tu risques de galérer pour obtenir un clone avec ton gène sans erreur.
Je commencerai directement avec la Phusion, ou la Q5 histoire de limiter les dégats.

J'essayerai de faire une gamme de matrice j'ai souvent remarqué que les conseils des fournisseurs étaient..... bof

YOyo

[invite34baa467]

J'ai testé tes amorces sur un programmes pour vérifier leur design et ils sont vraiment très mauvaise, je pense qu'avant toute chose tu dois vraiment redesigner.

Ensuite,après avoir refais le design je pense que tu pourras te renseigner sur le sujet et effectué une PCR touchdown.

Mais si tu as beaucoup de bande aspécifique , c'est soit le design des amorces mauvais ou la température pas assez stringeante mais vu que tu as fait les test de température, c'est vers les amorces que tu dois te tourner

Bon courage

[invite8d3fede1]

Déjà merci à tous pour vos idées !

Pour le MgCl2, j'ai fais varier la concentration car je n'optenais rien comme produit de PCR avec la concentration native de 2 mM du Dream Taq buffer et ça dans un éventail de température d'annealing de 50 à 70°C. La seule fois où j'ai obtenu quelque chose c'est sur une run 60-65°C à 3 mM de MgCl2.

Ensuite j'utilise la Dream Taq car je n'obtiens rien (plutôt le doctorant qui m'encadre) avec la phusion, donc je préfere me rôder sur la dream Taq au lieu de bouffer de la phusion, plus chère, pour rien.

Enfin, pour les amorces par contre je sais qu'elles sont un peu bancal entre elles mais elles sont tout à fait complémentaire de ma matrice (enfin sauf pour les sites de restriction évidemment), j'ai blasté sur ncbi et vérifié avec snapgene viewer.

Dans tous les cas j'ai refais une PCR cette aprem en faisant varier annealing, MgCl2 et concentration en matrice, je vous tierns au courant si j'ai les résultats ce soir héhé !
Je vais également essayer de vous mettre l'image du seul gel où le produit est présent (malheureusement je n'ai pas gardé le gel afin de récuperer la bande car je l'ai jugé trop failblarde).

[Loupsio]

Pour le MgCl2, j'ai fais varier la concentration car je n'optenais rien comme produit de PCR avec la concentration native de 2 mM du Dream Taq buffer et ça dans un éventail de température d'annealing de 50 à 70°C. La seule fois où j'ai obtenu quelque chose c'est sur une run 60-65°C à 3 mM de MgCl2.

Comme je te disais, tu vas perdre plus de temps qu'autre chose, mais bon après c'est toi qui voit...
Si il n'y avait pas de problèmes ( a part la concentration de Mg), tu aurais quand même un produit, le fait que tu ne vois rien indique qu'il y a un probleme autre, alors oui varier un peu kles concentration de Mg peuvent legerement améliorer un tout petit peu le truc, mais de facon aléatoire, non répétable et pas dans de grandes proportions, le vrai probleme n'est pas la, tu ferais mieu de mettre de coté le Mg et t'occuper du vrai souci, quand tu auras réglé ca, tu pourra faire varier ton Mg tu auras un produit dans tout les cas (plus ou moins bonne qualitée de PCR, mais produit visible)

Enfin, pour les amorces par contre je sais qu'elles sont un peu bancal entre elles mais elles sont tout à fait complémentaire de ma matrice (enfin sauf pour les sites de restriction évidemment), j'ai blasté sur ncbi et vérifié avec snapgene viewer.

Je confirme ce que te disait neoange, tes primers sont de mauvaise qualité, regarde rien que ca :

Il faudrai effectivement faire quelque chose de ce coté là

Dans tous les cas j'ai refais une PCR cette aprem en faisant varier annealing, MgCl2 et concentration en matrice, je vous tierns au courant si j'ai les résultats ce soir héhé !
Je vais également essayer de vous mettre l'image du seul gel où le produit est présent (malheureusement je n'ai pas gardé le gel afin de récuperer la bande car je l'ai jugé trop failblarde).

faire varier l'annealing et le Mg c'est à la fois une perte de temps et d'enzyme, si tu as mis la température indiquée par le calculateur fourni par les producteurs de l'enzyme, elle est censée correspondre, et si tout va bien mis a part la température ca ne devrait pas non plus etre trop gênant si on te dis une temperature "T" et que tu met T+5 ou T-5 tu devrais aussi avoir un produit

une comparaison que je trouve assez proche serait de vouloir faire de la place sur ton PC pour pouvoir y ajouter un film de 1 Go (1000 Mo) et que pour ce faire, au lieu de virer des films de 700 Mo, tu retire des photos a 3Mo... effectivement ca peut jouer, ca peut etre suffisant (selon la place qu'il te manquais, le nombre de photos que tu vas virer...) mais ce n'est pas prendre le problème par le bon bout, car les actions bien que vraies, n'on qu'une action limitée par rapport a ce que tu cherches a faire
Et pour moi c'est exactement ce que tu fais avec le Mg et la température

(malheureusement je n'ai pas gardé le gel afin de récupérer la bande car je l'ai jugé trop failblarde).

ce n'est pas la bande que tu aurais du garder pour amplifier, mais le produit lui même car après purification de gel il y à perte de toute facon. En revanche quand tu charges sur ton gel après ta PCR tu n'est pas obligé de tout charger, tu as entre 20 et 50 microlitres, tu peux te contenter de charger 10 microlitre et si tu as une légère bande (mais que c'est la seul après 1000 tentatives) tu prend le reste de solution (que tu n'as pas chargé sur gel) et tu amplifie soit pure, soit dilué 50 à 100 fois

J'espère que tu as eu de bons résultats dans la journée,
si ce n'est pas le cas, pense aux conseils qui t'on été donnés plutot que de t'obstiner
Bonne chance