Western Blot et coomassie

[inviteaf69fbdd]

Bonjoir à tous, je vous écris car dans le cadre d'un TP à la faculté j'ai réalisé 2 gels acrylamides. Le premier étant pour faire une SDS PAGE avec coloration coomassie et le deuxieme pour faire un western blot.
J'ai déposé la même protéine dans les 2 cas et je voulais savoir que m'apporte de plus le western blot ?
Pour moi la coloration coomassie va me permettre d'estimer la concentration de ma protéine en me référant aux puits ou j'ai déposé ma gamme de concentration connue.
Dans le cas du western, l'encadrant nous a dis de déposer 1/4 de la quantité déposé pour le coomassie. Y'a t'il une raison ?
D'avance merci pour vos explications.
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[Flyingbike]

Le western blot est spécifique (utilisation d'anticorps) alors que le coomassie pas du tout (on voit toutes les protéines)
Le WB est aussi énormément plus sensibles (qq ng vs qq ug pour le coomassie)

Quel était le but ?

[inviteaf69fbdd]

merci pour votre réponse. Le but était d'estimer la concentration de ma protéine. j'ai noté qu'on faisait un WB pour voir si la protéine était dégradée , est ce vrai ?
je ne comprends pas trop...
Merci

[Flyingbike]

en fait on colore au bleu de coomassie toutes les protéines du gel. Si c'est une protéine purifiée, ou une protéine produite in vitro, ça peut suffire puisqu'elle sera largement majoritaire. Sur un lysat cellulaire par exemple c'est plus difficile puisqu'il y a des milliers de protéines différentes mélangées, et dans ce cas un bleu de coomassie n'apporte pas grand chose (a part pour avoir un profil, une mesure globale de quantité, etc.)

Avec le bleu on a deux informations : la taille et la quantité. Par contre si vous avez un problème technique qui fait que vous produisez une protéine de taille identique a celle attendue mais pas celle attendue, vous ne le saurez jamais !

Le western blot utilise pour révéler la protéine des anticorps spécifiques. On a donc deux (meme trois) informations : la taille, la quantité et la "qualité" : si vous détectez votre protéine vous êtes sur que c'est bien elle, pas d'usurpation possible. C'est une information de spécificité.

Notons que la dégradation s'accompagne d'une modification de la taille, ce qu'on peut aussi voir en coomassie !

[A voir en vidéo sur Futura]

[inviteaf69fbdd]

Merci à vous. Dans mon cas, c'était une protéine purifiée et on arrivait pas à quantifier par coomassie donc on a fait un WB