Bonjour tout le monde,
Je suis quelque peu préoccupé par une question à laquelle je ne trouve pas de réponse.
Je dois déterminer si l'expression d'un gène, introduit par transduction dans des cellules, s'exprime bien.
J'ai réalisé à cet effet une RT-PCR suivie d'une PCR, après avoir fait un gel d'agarose, faut-il que je fasse autre chose pour pousser plus avant cette "inspection" de l'expression de mon gène ?
Merci pour vos réponses,
Message deplace dans une rubrique plus appropriee. Yoyo
Salut,
La RT-PCR est une technique tres sensible, malheureusement il y a bcp d'etapes quipeuvent faire que malgre la presence de ton gene, rien n'est amplifie.
La premiere chose est evidemment la qualite de tes oligos et leur capacite a s'apparier.
Le second probleme evetuel est la quantite de ton amteriel de depart. Si tu es parti d'ARN totaux, je te conseillerais de faire d'abord une purification des ARN polyA, ca enrichira la quantite de ton ARNm dans la popluation d'ARN.
Ensuite le dernier parametre important est la taille de ta rt-pcr.
En effet je me suis rendu compte que plus le fragment est petit mieux ca amrche, et ce malgre les plaquettes commerciales affirmant que tu peux reverse transcrire 10Kb.
En gros un fragment de 200nt est une taille qui me parait ideale pour prouver l'existence du transcript.
Si tu n'obtiens rien en RT-PCR, tu peux toujours essayer en Northern Blot, mais je ne crois pas que ca soit plus sensible. Sinon tu as aussi la possibilite de faire de la PCR en temps reelle, mais faut pposseder l'appareillage.
Un des points critiques quand tu fais un grand nombre de cycle de PCR (35) est de t'assurer de l'absence de contaminants, et surtout que tu n'amplifies pas l'ADN. Pour cela un traitement efficace a la DNAse est absolument indispensable.
J'oubliais de dire, qu'une autre facon de tester l'expression de ton gene, est de verifier la presence de la proteine par western blot. en comparant cela avec les proteine d'une cellule non transfectee. Cela necessite, cependant, d'avoir des anticorps contre ta proteine, ou d'avoir ajouter un "tag" a ta proteine.
J'espere avoir pu t'aider, sinon n'hesite pas a preciser ta question.
Yoyo
Jsute pour te dire merci Yoyo pour la rapidité de ta réponse te sa précision.
à +
