Bonjour à tous, je vous sollicite pour une petite explication concernant la mutagénèse dirigée. Je pense ne pas tout avoir compris et j’ai un exercice à faire.
L’exercice est de créer 2 amorces pour introduire une mutation en remplaçant un acide aminé par un autre.
J’ai la séquence d’un gène codant pour une protéine sauvage et j’ai la séquence du gène codant pour la protéine mutée pour une espèce A. On sait donc qu’aux alentours de la position 200 on a un changement d’un acide aminé entre la forme sauvage et mutée
On veut créer la même mutation chez une autre espèce B et on a la séquence du gène codant pour la protéine sauvage.
Dites-moi si ma démarche est bonne svp…
Dans un premier temps j’envisage d’aligner les séquences protéiques des 2 protéines sauvages et identifier l’acide aminé qu’il faudra modifier.
En remontant à la séquence nucléotidique j’aurai donc le triplet codant pour cet acide aminé.
A partir de là je remplace donc le triplet (en modifiant 1 ou 2 nucléotides pour avoir le triplet codant pour le nouvel acide aminé voulu). Ce triplet sera donc le centre de mon amorce et notre prof nous a dit de prendre 10 nt avant et 10 nt après ce triplet pour faire l’amorce.
Si j’ai bien compris j’aurai donc 10 nucléotides puis mes 3 nucléotides puis encore 10 nucléotides mais mon problème est le suivant. On est sur un plasmide et je dois faire l’amorce forward et reverse et je ne sais pas comment faire la 2eme (sous réserve que la méthode que j’ai décrite est correcte).
De plus, la méthode décrite est pour la forward ou pour la reverse ?
J’avoue être un peu perdu ….
D’avance merci pour votre aide
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