Expression d'une protéine

[invite805b0b2a]

Bonjour,

Dans le cadre d'un travail personnel, j'ai pour objectif d'exprimer une protéine d'une bactérie dans la bactérie E.coli.
Je connais la séquence du gène, et je sais quel plasmide je dois utiliser, le plasmide pET3a. Je rencontre un problème et je n'ai trouvé aucune réponse dans le forum (ni ailleurs d'ailleurs).

La séquence du gène comporte en 5' un site BamH1, et c'est le seul site du gène. Je voudrais insérer ce gène dans le vecteur d'expression mais je dois créer des sites de restriction en amont et aval du gène et je ne sais pas comment faire. En fait, si j'isole mon gène depuis la bactérie, je me retrouve avec 617 pb, comment puis-je ajouter des nucléotide amont et aval pour créer des sites de restriction (mutation par PCR) sur ces sites ?

Peut-on ajouter aux extrémités d'une séquence des nucléotides de notre choix ?

Je vous remercie d'avance!
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[invite2eb5a45f]

Oui, en fait c'est relativement simple.

Il suffit de rajouter les sites de restriction avant l'ATG sur le primer forward, et après le STOP sur le primer reverse, en prenant soin de rajouter quelques nucléotides (j'en met 5 perso) de part et d'autre pour faciliter l'assise des ER.

Comme ceci.

[invite805b0b2a]

Je n'ai pas accès à l'image, mais je crois que c'est ok!
Mon problème étant surtout que je pensais seulement avoir la séquence à partir de l'AUG, mais j'ai bien l'ensemble du gène : je change seulement quelques bases au début pour créer un site.

Merci Pour votre temps