Miniprep qui ne marche pas

[invite46da44ad]

Bonjour à tous.
Je suis actuellement en stage et toute seule car mes encadrants sont parti en vacances.
Apres avoir réalisé un clonage de 20 plasmide puis des transformations bactérienne, et culture bacterienne j'essaye depuis quelques jours d'extraire mes plasmides.
J'utilise un kit mini prep de la marque QIAGEN (datant de 2011 et dont les solutions sont qasi vide), lors de l'analyse sur gel d'agarose, je n'obtient aucune bande de migration.
J'ai décidé de réaliser une lyse alcaline grace a un protocole trouvé sur internet, cet fois ci je n'ai réussi a extraire que de l'adn génomique ( ce que j'en ai déduis vu la taille).
Je ne sais comment débloquer ce probleme .
j'ai déjà fait plusieurs miniprep durant des stages précédents ça a toujours fonctionné ... la je sèche complètement.

Auriez vous des conseils ?

Je vous en remercie par avance
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[invite2eb5a45f]

Est-ce que tu as des kits de Maxi/Midi Prep dans ton labo ? Personnellement c'est ce que j'utilise.

Tu resuspends dans 200 µL de RES, tu ajoutes 200 µL de LYS, 5 min à RT, puis 200 µL de NEU. Centri à Vmax 10 min à 4°C puis tu précipites le surnageant avec 450 µL d'isoprop, et centri à Vmax à 4°C pendant 30 min. Ensuite tu laves le culot à l'éthanol 70%.

[invitea9e5d0fd]

Es-tu certaine d'avoir des plasmides dans tes bactéries ?
Quels sont les résistances portées par ces plasmides ? Teste les bactéries pour ces résistances.
Une PCR sur colonie pourrait aussi t'assurer de la présence des plasmides.

Si tu as bien des plasmides dans les bactéries alors ton kit est peut être mort, sinon c'est effectivement le protocole.

Victor

[invitef6c1d3c5]

Si la solution de lavage de la colonne du kit ne contenait pas d'éthanol, ça entraine l'élution et donc la perte de l'ADNp (ça met arrivé une ou deux fois ...). Si tu n'as plus de kit, voici une méthode "à l'ancienne" qui marche très bien :
trois solutions S1-S2-S3 :
S1 : Trix/HCl pH 7.4 50 mM - EDTA 10 mM - RNase A 100µg/ml (en fait c'est en gros la solution RES de Tibosax)
S2 : NaOH 200 mM, SDS 1% (p/v) (idem c'est la solution LYS)
S3 : Acétate de potassium 2.55M pH 4,5/ acide acétique 10% (v/v) (solution NEU)

Reprendre le culot dans 150µl de S1 et remettre en suspension
Ajouter 150 µl de S2, homogénéiser MAIS ne pas vortexer, 5 min à T°C ambiante
ajouter 150µl de S3, mélanger par inversion (ne pas vortexer)
Centrif de 10 min à Vmax. Récupérer le surnageant (on peut refaire une centri si on a embarquer par erreur du dépot blanc qui est l'ADN génomique qui a précipité)
Ajouter 1 volume (500 µl environ) d'isopronanol
Centri à Vmax 30/40min à 4°C ensuite lavage classique (EtOH 70%) et reprendre dans de l'eau

Bon courage

[A voir en vidéo sur Futura]