Aide cytométrie en flux

[jujutou]

Bonjour à tous,

Je suis actuellement en stage de biologie (actuellement en confinement, mais on va redémarrer).

Avant le confinement, nous avons réalisé des expériences de cytométrie en flux ... Et je dois répéter les expériences en autonomie, mais il y a quelques choses que j'ai du mal à savoir et comprendre.

Quelles sont les étapes indispensables pour réaliser une bonne analyse en cytométrie en flux ?

Nous utilisons plusieurs couleurs (anticorps) pour faire du multi-marquage, et il y a toute une histoire avec les compensations... J'ai demandé plus d'explication à mon maître de stage, mais ça me parait toujours flou ...

En gros, quelles sont les conditions et marquages à réaliser pour que tout soit analysable ensuite (sur flowjo).

Il faut faire des échantillons sans anticorps, avec uniquement un seul anticorps, avec les isotypes, ... ??
Je suis un peu perdu.
Concrètement, lorsque l'on doit calibrer les compensations, quels échantillons utilisent t-on ? Les isotypes ou un échantillon avec l'anticorps en question pour le calibrage ? Dans ce cas pourquoi, quand et ou utiliser les isotypes ?

Merci de votre aide !
(j'espère avoir été clair avec ma question ?)
J'aimerais que ça soit clair dans ma tête pour reprendre efficacement !
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[Flyingbike]

rhoalala on peut difficilement vous aider sur le forum. La cytométrie est une méthode complexe, surtout quand on fait du multi couleurs. Il y a plusieurs façon de procéder en plus, selon le degré de rigueur et de complexité des marquages.

Il faut probablement que vous demandiez à être supervisé à nouveau, c'est ce qui me parait le plus simple.

Le plus simple est probablement de commencer par faire des monomarquages sur un pool d'échantillons, et à régler d'une part les photomultiplicateurs pour ajuster la séparation positifs/négatifs, puis du même coup s'assurer qu'il n'y a pas de signal dans les autres canaux. On peut idéalement aussi réaliser des marquages "tous sauf un" pour régler les seuils et les gates.
On peut utiliser ou non des isotypes selon le budget et d'autres critères internes, tout comme utiliser des billes de calibration ou de test de marquage.....

Honnêtement c'est un métier. Peut être que des guides comme celui ci peuvent aider ?
http://cytobase.montp.inserm.fr/ftp/Panel%20Design.pdf

[jujutou]

Merci pour votre réponse et le document !

En effet, c'est compliqué et quand j'en discute avec quelqu'un ont me donne des conseils différents a chaque fois ... Donc je ne sais plus ou donner de la tête...

Le document est très intéressant ! mais complexe ^^'

En faite, ce que je souhaite savoir, c'est pour les contrôles compensations, lorsque l'ont active la fonction sur le logiciel Diva
On obtient ceci :


Quelles conditions faut-il utiliser ?
Dans le Unstained Control (cadre rouge), il faut mettre un échantillon sans marqueur ou avec les isotypes ?
Et dans les contrôles (PE control et les autres), il faut mettre l'échantillon avec uniquement le marqueur en question (PE ici) c'est ça ?

Où utilise t-on les isotypes alors ?

C'est surtout ça mon interrogation. Après les détails plus complexe, c'est trop compliqué pour mon niveau pour l'instant.
En tant que stagiaire, je veux surtout connaitre les contrôles de base pour m'a avoir fait des expériences pour "rien" parce que j'ai pas utiliser les bons contrôles et autres.

Merci de votre aide !

[Flyingbike]

je vais devoir sortir mon joker. J'ai utilisé ponctuellement DIVA mais en traitant les contrôles comme des échantillons normaux qui étaient ensuite retraités sur FlowJo

Unstained se réfère à l'échantillon non marqué, idéalement avec les isotypes

les "XXX Control" doivent être les monomarqués effectivement.

[A voir en vidéo sur Futura]

[jujutou]

D'accord !
Je te remercie !!