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Problème en HPLC



  1. #1
    oma2000

    Problème en HPLC


    ------

    Bonjour à tous!

    Je viens de m'inscrire sur le forum car j'ai un problème et peut-être que certaines personnes vont pouvoir m'aider ici. En retour, je vais essayer de participer au forum et pourquoi pas aider les autres le jour où ils auront des problèmes.

    Voilà ce qui m'amène :
    Je viens de commencer un stage dans un laboratoire de chimie et je travaille sur une HPLC.
    Le problème, c'est que je n'avais jamais utilisé ce type d'appareil auparavant et que mon encadrant est très pris et ne m'a quasiment rien expliqué.
    Je travaille avec une colonne phase inverse C18 et avec un éluant eau/acétonitrile
    J'ai fait plusieurs injections qui se sont bien passées mais depuis hier, la pression est devenue très élevée (>200 bar) et la manip s'est même arrêtée avec un message qui disait quelque chose comme "high pressure limit"
    Je ne comprends pas ce qu'il s'est passé, est-ce que la colonne peut être "bouchée" ? Si c'est le cas, est-ce qu'elle est fichue ?

    J'ai fait passer du chloroforme dans la colonne en utilisant la pompe qui prélevait l'acétonitrile. Est-ce qu'il fallait changer le filtre ou autre chose ?
    J'ai peur que ce soit cette manip qui ait endommagé la colonne.

    Bref, mon stage commence mal, j'ai peur d'avoir vraiment tout cassé.

    -----

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  3. #2
    HarleyApril

    Re : problème en HPLC

    il se peut en effet que la colonne soit bouchée
    à moins que ce ne soit la précolonne s'il y en a une
    il est possible de faire un programme de rinçage
    le mieux est de voir ledit programme en fonction du produit que tu injectes afin d'utiliser des solvants adaptés

    dans le pire des cas, une colonne C18, c'est pas hors de prix (300€) et ça vous apprendra qu'il faut mettre une précolonne

  4. #3
    Cosmochimicher

    Re : problème en HPLC

    Salut,

    Ce que tu décris correspond effectivment à un colmatage de colonne, quesque tu à injecté ? à tu filtré la solution que tu à injecté (filtre millipore) ? à tu vérifié qu'il n'y ait pas de dépot dans les flacons d'éluants ?
    La colonne n'est peut être pas foutue si elle est nunie d'une près colonne (ou colonne de garde : petit bout de colonne de phase fixe simillaire placé en amont de la colonne d'analyse qui permet d'éviter ce genre de problème ou qu'un soluté si fixe de manière définitive).

    Vivien

  5. #4
    oma2000

    Re : problème en HPLC

    Merci à vous deux,

    Malheureusement, il n'y avait pas de pré-colonne. J'ai essayé de faire passer différents solvants pour voir si je pouvais la déboucher mais rien n'y fait. Avec un débit de 0,5 mL/min, j'ai une pression de 200 bars. Je pense qu'elle est vraiment fichue.

    J'ai injecté des solutions faites dans un tampon avec des sels (0,1 M au total) et avec une protéine à 1 g/L. Mais cette colonne n'était pas neuve, la première fois que je l'ai utilisée, la pression était déjà de 170 bars pour un débit de 1 ml/min.

    J'ai trouvé une procédure de nettoyage sur le net :

    http://www.gazettelabo.fr/2002archiv...996/11hplc.htm

    Je ne comprends pas le sens de cette phrase :

    "Si l'efficacité de votre colonne diminue, il est possible de revitaliser la colonne dans sa pré-colonne".

  6. #5
    HarleyApril

    Re : problème en HPLC

    je suppose que c'est une faute de frappe, le s est juste à côté du d
    ce serait donc 'sans sa précolonne'

    reprends tes sauces pour voir si quelquechose précipite dans l'éluant (sans rien injecté)
    il se peut, par exemple, que les sels précipitent à cause de l'acétonitrile
    ça te renseignera sur la nature de ce qui bouche
    essaye le rinçage en montant la colonne à l'envers, tu la reconditionnera ensuite à l'endroit

    bonne chance
    (on a eu une colonne bouchée il y a quinze jours et on s'en est sorti comme ça !)

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    oma2000

    Re : Problème en HPLC

    Merci beaucoup, je vais essayer.

  9. Publicité
  10. #7
    koni

    Re : Problème en HPLC

    As tu fait attention à la micibilité de tes solvant parce que j'ai vu que tu as fait passer du CHCl3 si tu as bien rincé avant avec acétonitrile 100% il n'y a pas de probème mais si tu as passer le chloroforme alors qu'il restait de l'eau dans la colonne ca peut poser un sérieux problème. En cas de pression élevée ce que je fait c'est que je met la colonne à l'envers (eluant circule en sens inverse de la flèche indiquée sur la colonne) à faible débit (0,1-0,2 mL/min) avec un éluant EUP:MET (50:50) tu laisse 1 jours ou 2 (prend une simple pompe isocratique... c'est pas la peine de squater une chaine entière pour ça...)... tu verra bien mais en général c'est assez efficace. C'est quoi la ref de ta C18?

    PS : n'oubli pas de rincer pendant plusieurs heures avec du methanol 100% pour eliminer le chloroforme avant de passer à l'éluant eau:methanol.

  11. #8
    mahnah

    Re : Problème en HPLC

    Ca m'est arrivé que ce soit bouché avant la colonne (sans précolonne). A voir si sans la colonne, le même problème se produit. Sinon, effectivement, c'est la colonne.

  12. #9
    laura7777

    Re : Problème en HPLC

    Tu peux aussi essayer de passer un mélange méthanol/eau pendant la nuit (50/50) ou aussi vérifier tes tubes de liaisons en les remplaçant un par un (s'il y en a un de tordu, cela peut expliquer la forte pression).

  13. #10
    manwel

    Re : Problème en HPLC

    Bonjour,
    Je travaille sur une colonne de type KW-804 (gel de silice couvert des groupes hydroxy hydrphiles) (commercialisé par Shodex). J'ai un problème de pression élévée qui est de 0,85 Mpa pour un débit de 0,1 ml/min, je pense qu'il y'a eu un colmatage de la colonne (j'ai passé un jus brut contenant plusieurs composés). Y'a t'il une solution pour ce type de problème. Comment s'assurer que l'augmentation de la pression est du au colmatage et non à la présence des bulles d'air.Je vous remercie pour votre aide

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