purification d'un sucre sur colonne

[invite32591b78]

Bonjour,

Je suis en stage depuis septembre et dois, pour venir à bout de mon projet, synthétiser un sucre (6-azidofucose peracétylé, si ça peut aider). Après nombre de problèmes, je suis enfin arrivée à la dernière étape de peracétylation. Je pense avoir mon produit mais dois encore le purifier sur colonne chromatographique. Le protocole que je suis me dit d'utiliser comme éluant Hexane:Acétate d'éthyle 2:1. Or, quand j'utilise ce mélange, mon produit reste coincé tout en haut de la silice (pourtant il montre un Rf de 0,34 sur CCM). J'ai donc essayé d'utiliser un éluant plus polaire comme Dichlorométhane:Méthanol 98:2 (qui fait monter mon produit a un Rf de 0,52, je sais c'est un peu beaucoup mais je voulais essayer) et surprise: le produit reste encore coincé en haut. En désespoir de cause, je l'ai élué avec du méthanol pur, ne serait-ce que pour voir si c'était bel et bien mon produit. Et en effet, il semblerait que c'est bien lui, mais évidemment, il n'y a eu aucune séparation donc il n'est pas plus pur qu'avant d'entrer sur la colonne.

Je voulais donc savoir si quelqu'un aurait un explication a ces phénomènes et quelques suggestions pour m'aider: pourquoi mon produit brut a l'air de bien se séparer sur CCM mais reste coincé dans la colonne? comment pourrais-je "décrocher" mon produit du haut de la colonne tout en espérant une séparation correcte?

Merci d'avance!
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[invite42d02bd0]

c'est la même silice qu'il y a sur ta ccm et que tu utilises pour ta colonne?

Ta colonne n'est pas trop longue?

Tu es certains que c'est ton produit que tu vois sur CCM? et pas autre moins polaire?

Et quand tu élues au méthanol pur, tu retrouves tout ton produit? Tu es sur que tu n'as pas trop dilué ton produit et qu'il sort lentement, mais que tu n'arrives pas à le révéler?

[invite32591b78]

Dans l'ordre:

Je ne sais pas si il s'agit de la même silice, je n'ai pas fait attention aux spécifications. Cela influe énormément?

La colonne est aussi longue que toutes les colonnes que j'ai pu faire jusqu'ici (en gros une trentaine de centimètre de haut) mais vu que le produit ne descend pas DU TOUT avec les mélanges d'éluents que j'essaye, je ne peux même pas espérer jouer là dessus.

Je révèle mon produit spécifiquement (je tranforme l'azide en amine et le révèle avec de la nynhidrine) donc je pense que oui, ce que je vois à 0,4 ou 0,5 sur la CCM est bien mon produit. De plus, ce Rf de 0,4 dans l'Hex:AcEt est celui précisé sur le protocole que je suis. De même, ce que j'ai élué au méthanol réagi également et migre au bon Rf.

Si mon produit était dilué dans les fractions précédentes, je ne l'aurai pas vu descendre aussi bien avec le méthanol. Quant à savoir si j'ai tout réccupéré, je ne sais pas trop parce que je n'ai pas taré mon ballon avant la puif.

J'opterai plutôt pour une bêtise du genre démixion de solvant sur la colone ou précipitation pour je ne sais quelle raison mais je ne sais pas comment expliquer ni résoudre ce genre de problème...

[invite32591b78]

oops, je me rends compte que je n'ai même pas dit merci pour l'aide et la rapidité je me rattrape: MERCI!

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite42d02bd0]

mais quand tu déposes ton produit sur la colonne, il est soluble dans ton éluant non? Même un produit peu soluble dans l'éluant passe sur colonne, il va juste sortir en plus de tubes...

C'est étrange... Soit tu as une silice très très différente entre ta ccm et ta colonne (mais tu aurais du t'en rendre compte avec les colonnes prédécentes que tu as effectués).

Honnetement je ne comprend pas...

[invitea85ccf09]

J'ai donc essayé d'utiliser un éluant plus polaire comme Dichlorométhane:Méthanol 98:2 (qui fait monter mon produit a un Rf de 0,52, je sais c'est un peu beaucoup mais je voulais essayer) et surprise: le produit reste encore coincé en haut

Comment sais tu qu'il reste "coincé" en haut, il est peut être sur ta colonne mais met du temps à descendre.

En désespoir de cause, je l'ai élué avec du méthanol pur, ne serait-ce que pour voir si c'était bel et bien mon produit.

On m'a toujours déconseillé d'utiliser un éluant trop "riche" en MeOH car ce dernier dissous légèrement la silice et risque donc mettre de la silice dans tes fractions de récupération.

Dans l'ordre:

Je ne sais pas si il s'agit de la même silice, je n'ai pas fait attention aux spécifications. Cela influe énormément?

Comment veux tu reproduire les conditions de ta CCM si tu ne prends même pas les mêmes conditions de séparation, es-tu même sûre que ce soit de la silice et pas de l'alumine (dont il existe au passage trois variantes : une acide, une neutre et une basique)?

La colonne est aussi longue que toutes les colonnes que j'ai pu faire jusqu'ici (en gros une trentaine de centimètre de haut) mais vu que le produit ne descend pas DU TOUT avec les mélanges d'éluents que j'essaye, je ne peux même pas espérer jouer là dessus.

La longueur de ta colonne c'est une chose certes, mais quelle quantité de "silice" as tu pour quelle quantité de produit déposé sur la colonne ?

Tu peux tenter de décrocher ton produit en rajoutant un peu de triéthylamine dans ton éluant après un certain volume élué (quelques gouttes suffisent).

Si tes impuretés sont déjà sorties auparavant (vu que ton produit est plutot du genre pot de colle), rien ne t'empeche de réussir à purifier ton produit si tu fait un gradient de polarité.

[invite32591b78]

Bonjour,

Merci pour ces commentaires et conseils. Je m'excuse de ne pas avoir réagi hier, mais je n'étais pas au labo.

Alors, je dis que mon produit est "coincé" en haut car je vois un anneau jaune qui ne bouge absolument pas du haut de la colonne. Si mon produit est incolore et que je ne le vois pas descendre, alors il devrait apparaitre sur les CCM. Je ne pense pas qu'il soit "trop dilué pour être détecté" car le test à la nynhidrine est relativement sensible. Et puis mon élution au méthanol m'a bien montré que le produit n'était pas encore sorti...

J'apprécie les remarques sur le fait que le méthanol pouvait dissoudre la silice et sur le fait qu'il exuste différents types de CCM. Je ne le savais pas... Je regarderai à cela.

Petite nouveauté qui permettra pet-être à certains de mieux comprendre (moi pas mais qui sait...): Après avoir concentré mon produit en évaporant le méthanol avec lequel j'avais tout élué sans pitié, j'ai obtenu une huile jaune. J'ai voulu refaire un CCM dessus et en ai dissout un peu dans du dichlorométhane. Et là surprise, l'huile dissoute et un précipité blanc a crié. J'ai donc reproduit l'expérience sur ce qu'il me restait de produit et en effet, j'obtient un solide blanc, réactif à la nynhidrine qui plus est donc c'est peut être le bon. Conclusion: mon produit (si c'est bien lui) n'est pas soluble dans le diclo pur. Pourtant l'était dans Diclo:MeOH 98:2 quand je l'ai déposé en haut de ma colonne. Est ce que cela peut être la raison de mon problème? Si oui, que s'est-il passé sur la colonne?

J'aimerai comprendre afin de pouvoir refaire ma synthèse... Quelqu'un a une idée?

[invite32591b78]

euh, je ne sais pas ce qui s'est passé mais la phrase "l'huile dissoute et un précipité blanc a crié" aurait du être "l'huile s'est dissoute et un précipité blanc s'est fromé"...

Désolée....

[HarleyApril]

fromé, vraiment ?

un solide blanc après élution au méthanol, ça peut souvent être de la silice, méfiance ...
visiblement, dans ton cas, ce n'est pas ça, puisque ton produit blanc réagit à la ninhydrine (mais ce peut être de la silice avec un poil de bon produit)
prend le point de fusion de ton précipité blanc
si ça fond pas, c'est de la silice !

sinon, je suis étonné que tu puisses dissoudre ton produit dans un solvant à base d'acétate d'éthyle et ensuite même plus dans le dichlorométhane

enfin, pour passer sur un registre plus optimiste, si c'est bien ton produit, il se peut qu'il soit beaucoup moins soluble pur que sale
ainsi, en commençant la chromato, tu le purifies, il cristallise et ne veut plus se redissoudre

cordialement

[invite32591b78]

Oops, pardon pour le "fromé"

J'ai eu peur en effet que le solide blanc soit de la silice après le commentaire de Ragalorion d'où le test à la nynhidrine. J'en ai emmené un petit échantillon à le RMN pour être sûre quand même (mais je n'ai pas encore le résultat) mais j'avais tellement peu de produit que je ne sais pas si je vais pouvoir tester le point de fusion

Par curiosité: Harley April, c'est quelque chose qui se produit de temps en temps qu'un produit soit rendu plus soluble par les impuretés et donc précipite au cours de la purification ou c'est une théorie suite à mes précisions mais tu n'en as jamais entendu parler? Si c'est cela, peut être puis-je tenter d'augmenter la quantité de méthanol dans mon éluant pour faciliter la solubilisation sans pour autant en arriver à l'extrême 100% du désespoir pour garder un semblant de séparation... Jusqu'à quel pourcentage de MeOH peut-on espérer ne pas trop dissoudre la silice? Ou bien quel autre solvant pourrais-je utiliser avec le dichlo qui ne pose pas ce problème?

Et enfin, Regalorion, tu avais suggéré, et je t'en remercie, que je mette quelques gouttes de TEA dans mon éluant (après avoir équilibré la colonne c'est ça?). Quelle était l'idée derrière? C'est pour neutraliser l'acidité de la silice? Comment cela aiderait-il à décrocher mon produit?

Merci encore à tous!

[invitedfb0f2c6]

Ben tu peut essayer un mélange DCM-Acétone en gradiant... Ça te dissous tout et sa élue bcp....

Quand tu dis que tu pense être le bon produit, c est que tu a une référence ou c est juste une appréciation personnelles?

Tu a vérifie que ta pissette ou ta bouteille de solvant contient le bon solvant (demande a un thésard de verif...) Quand on creuse un peu c est généralement la source de ce genre de problème... (une bonne demidouzaine de fois ce problème avec les resserves communes de solvant pdt la these ....

[invite32591b78]

haha, j'adore le coup de la pissette.
C'est vrai que c'est trop le genre de chose bête qui peut arriver. Mais là normalement y'a pas trop de risque: je suis la seule à manipuler ces solvants (je bosse dans un labo de biologie donc le dichlo et l'hexane, c'est pas trop leur truc) et je garde tout dans les bouteilles d'origine et pas dans des pissettes sinon ils ont peur que ca explose. (j'exagère un peu... )

Bref, merci pour la proposition DCM:Acetone. Je vais voir ce que ca donne sur une CCM, si je peux trouver un Rf correct et si ca dissout bien mon solide blanc et mon huile. Dois-je tenter le coup des quelques gouttes de TEA quand même? N'ayant pas compris à quoi cela servait je ne sais pas trop si le conseil est toujours valable pour une autre combinaison de solvants...

Merci encore!

[invitedfb0f2c6]

On utilise le TEA quand on a une tache en CCM qui a une forme comète (tu a ta tache avec une longue traine qui part du point dépôt) C est du a une interaction acide base entre ta silice et ton compose...
Donc si tu a un jolie rond sa sert a pas grand chose...

Sinon, tu fais dépôt solide ou liquide?
Tu prepare ton echantillon CCM comment? Tu utilise quel solvant pour dissoudre le compose (si c est le méthanol, ne cherche plus d ou viens le probleme

[invite32591b78]

Ah, en effet, j'ai une jolie trainée sur CCM dans mon produit brut. Je pourrais essayer le coup de la TEA... Mais sur la CCM que j'ai faite du solide blanc qui avait précipité au dichlo, ca n'a pa fait de comète. Ca a fait un petit trait oblique. J'en avais déduit que c'était une question de concentration dans mon échantillon...

Je fais un dépot liquide sur la colonne. Que ce soit des huiles ou des solides, je les dissout dans un peu de l'éluant avant de les déposer sur la silice.
Pour faire mes CCM, soit pareil, je dissous dans l'éluant, soit aussi souvent, je dissous dans le dichlo.
Mais pour mon produit blanc, vu qu'il ne se dissolvait pas dans le dichlo, je l'ai mis dans du méthanol... La CCM a marché pas mal... Mais tu as l'air de dire que c'est pas bien d'avoir fait ca. Pourquoi donc? Ca explique beaucoup de choses?

[invitedfb0f2c6]

Quand tu dissout ton produit ds le méthanol et que tu fait le dépôt, tu va tjrs laisser sur la silice un peu de solvant... Or le méthanol a même en ptite quantité un treeeeeeeees gros effet sur l elution de ton compose... Tu fausse alors complètement ta CCM... (apres sa depend tjrs de ton compose....)

Si tu a la traine il est donc intéressant d utiliser de la TEA (j en utilise jusqua 10% quand c est vraiment nécessaire...

[invite32591b78]

Merci pour les infos su le méthanol. Je ne savais pas que c'était un solvant si embêtant, autant pour les colonnes que pour les CCM.

Je vais retenter ma synthèse et ferai la purification selon les conseils de chacun (acétone-DCM, TEA, pas de méhanol sur la CCM etc) et verrais ce que cela donne.

Merci encore de votre aide. En espérant que ce la machera! Verdict dans quelques jours...

[HarleyApril]

bonsoir
pour répondre à ta question, le coup de la précipitation pendant la purification, ça arrive réellement, même si ce n'est pas hyper fréquent
la neutralisation à la triéthylamine est souvent utilisée, mais l'évaporation peut poser des problèmes
on utilise de la même façon de l'ammoniaque (il paraît que c'est moins pénible à évaporer)
pour ma part, j'ai un petit faible pour la silice neutralisée au bicarbonate (mettre la silice en suspension dans l'eau, neutraliser tant que ça fait des bulles, ajouter une spatulée pour la route, filtrer, sécher à l'étuve)
ces méthodes sont toutes équivalentes

cordialement