Solution tampon - extraction ADN

[invite24f624b1]

Bonjour à tous les chimistes,

J’ai besoin d’un petit coup de main. Je suis une biologiste et voilà que… je suis obligée de recourir à la chimie pour extraire de l’ADN de mes petits coraux de la grande barrière australienne.
Voilà mon problème : je dois préparer une solution tampon et y ajouter la protéinase K afin que cette dernière soit d’une concentration de 400 µg/mL.
Voici ce dont je dispose au labo:

Solution tampon:
-1% SDS
- 400 mM NaCl
- 5 mM EDTA (pH 8.0)
- 20 mM Tris-Cl (pH 8.0)

- Proteinase K : 20 mg/mL

J’aimerais obtenir une solution tampon d’un volume final de 50 mL.

Je me suis notée les masses molaires des différents produits : MNaCl = 58.44, MEDTA = 372.24 et MTrisCl = 157.64 car je pense que cela peut me servir.
J’ai en mémoire ces vieux souvenirs de chimie: les formules C1V1 = C2V2 et m = n × M

Un petit indice SVP ?

Je vous remercie d’avance et je vous renverrai l’appareil avec plaisir si vous avez des questions de biologie.
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[HarleyApril]

Bonsoir

Questions subsidiaires ...
Tu veux un tampon à quel pH pour que ta protéinase K fonctionne ?
Quelles sont les concentrations des autres ions dont tu as besoin ?

Sans ces éléments, je te conseille de diluer bêtement ta protéinase.
Tu veux 400µg/mL et 50mL, il te faut donc 400*50=20000µg=20mg
Tu as une solution à 20mg/mL, tu prends donc 1mL et tu amènes à 50mL avec le Tris

cordialement

(tu peux garder l'appareil, par contre, un aller retour pour la grande barrière, c'est pas de refus)

[invitee51ce47c]

Bonjour,

La solution à votre problème est aisément trouvée en consultant la bible des manuels en biologie moléculaire : Sambrook, Fritsch & Maniatis, 1989, Molecular Cloning : a laboratory manual, second edition, Cold Spring Habor Laboratory Press. En particulier, volume 3, "appendice B : préparation des réactifs et des tampons utilisés en biologie moléculaire".

Prérequis : j'imagine que vous savez déjà comment faire pour préparer des solutions et des tampons (pesée, dissolution, calibration et mesure du pH) et comment stériliser la verrerie/plastique de laboratoire avec une autoclave. Si vous devez faire une PCR à la suite de votre extraction d'ADN, j'imagine ce que vous maîtriser les conditions de propreté dans lesquelles on doit travailler pour empêcher toute contamination des échantillons récoltés par de l'ADN externe.

Ensuite, consulter les conditions dans lesquelles la protéinase K montre son maximum d'activité, comme par exemple : http://en.wikipedia.org/wiki/Proteinase_K
Données techniques et conditionnement de l'enzyme utilisée pour la biologie moléculaire : exemple : www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p2308
Certaines publications mentionnent les concentrations finales de l'enzyme en unités/ml. Il faut donc convertir les mg/ml en U/ml en sachant qu'avec le produit Sigma P2308 par exemple, on a 30 U/mg d'enzyme présent.

Les protocoles standards d'extraction d'ADN (Sambrook et al., 1989) parlent d'un tampon de lyse des tissus, typiquement 10 mM Tris-HCL, pH 8.0, 100 mM EDTA, pH 8.0, 20 mM NaCl, 1% (w/v) sodium dodécyl sulfate (SDS). Les tissus sont mis à digérer pendant 24 hrs à 50°C dans ce tampon de lyse contenant 1 mg/ml de protéinase K. Vous devez adapter ce protocole standard à vos conditions particulières, i.e., concentration finale 0.4 mg/ml de protéinase K.

Si vous devez éliminer l'ARN de votre extrait d'ADN, il faut tout d'abord incuber vos tissus dans du tampon de lyse contenant 0.6 mg/ml de RNase pendant 30 min à 37°C, puis ajouter la protéinase K à 1 mg/ml final et continuer la lyse comme décrit ci-dessus.

J'imagine que vous savez déjà préparer les tissus congelés pour l'extraction d'ADN (réduire les tissus en poudre à l'aide d'un mortier dans de l'azote liquide).

A propos de vos solutions tampons disponibles dans votre labo, je pense que cela doit correspondre à la concentration finale du tampon de lyse pour l'extraction d'ADN de coraux et non aux solutions mères:
-1% SDS
- 400 mM NaCl
- 5 mM EDTA (pH 8.0)
- 20 mM Tris-Cl (pH 8.0)

En effet et dans la pratique en biologie moléculaire, on prépare des solutions mères bien plus concentrées que ce que vous mentionnez ci-dessus, à savoir :

- 100 ml de 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, stérilisée à l'autoclave dans une bouteille en verre Pyrex (préparé en mélangeant 50 ml d'une solution mère 0.1 M Tris base dans laquelle on ajoute 29.2 ml d'une solution 0.1N HCl et on complète le volume avec de l'eau bi-distillée jusqu'à 90 ml dans un cylindre gradué. Contrôler la valeur du pH à 8.00. Si besoin, corriger avec 0.1 N HCl et compléter à 100 ml. Voir table B.2, Sambrook et al., 1989, Molecular cloning, a laboratory manual, vol. 3, pp. B.1.). Pour faire la solution 0.1 M Tris base, dissoudre 12.11 g dans 1 L d'eau bi-distillée. Pour faire la solution 0.1 N HCl, diluer 86.2 ml de HCl concentré (en principe à 11.6 N) dans 913.8 ml d'eau bi-distillée (sous chapelle + lunettes de protection personnelle).

- 1 L de 0.5 M EDTA pH 8.0 (préparé en ajoutant 186.1 g de EDTA-2H2O dans 800 ml d'eau bi-distillée dans un bécher en verre. Mélanger vigoureusement avec un barreau magnétique et ajuster le pH à 8.00 en ajoutant doucement environ 20 g de NaOH sous forme de pellets (attention, exothermique !). L'EDTA ne se dissout pas tant que le pH n'est pas proche de 8.00 avec l'ajout de NaOH. Répartir en 5 aliquots de 200 ml et stériliser à l'autoclave.

- 1 L de 5 M NaCl (préparé en dissolvant 292.2 g de NaCl dans 800 ml d'eau bi-distillée. Compléter à 1 L une fois totalement dissout. Répartir en aliquots et stériliser à l'autoclave.

- protéinase K, solution mère à 20 mg/ml dans de l'eau bi-distillée (100 ml d'eau bi-distillée dans une bouteille en verre pyrex stérilisée à l'autoclave). Répartir en aliquots de 0.2-0.5 ml dans des tubes eppendorf (tubes préalablement stérilisés à l'autoclave) et conserver à -20°C.

- RNAse A pancréatique, solution mère à 10 mg/ml dans 10 mM sodium acétate pH 5.2 stérile. Chauffer à 100°C pendant 15 min. Laisser refroidir à température ambiante. Ajuster le pH à 7.4 en ajoutant 0.1 volume de 1 M Tris-HCl pH 7.4 stérile. Répartir en aliquots dans des tubes eppendorf stériles et conserver à -20°C.

- 10% de SDS (préparé en dissolvant 100 g de SDS (qualité électrophorèse) dans 900 ml d'eau bi-distillée. Attention poudre très volatile, porter un masque de protection lors de la pesée ou travailler sous chapelle ! Chauffer à 68°C pour faciliter la dissolution. Ajuster le pH à 7.2 en ajoutant quelques gouttes de HCl concentré, puis compléter à 1 L. Répartir en aliquots (ne pas stériliser à l'autoclave).

Bonne chance dans l'extraction d'ADN de vos coraux australiens... Tenez-nous au courant de vos succès...ou de vos échecs !

Cordialement,

BCG