Histoire de concentration
Bonjour,
J'ai 50 mg de trypsine bovine pancreatic (23.3 kDa= 23.3 10^3 mol/l) que je dois redissoudre dans HCl 1 mM. L'article que j'ai trouvé pour faire mon test dit: "final concentration 0,163 µM prepared in 1 mM HCl". Je trouve que je dois diluer dans 13,165 litre mais ça me parait beaucoup...
(0.163*10^-6)*23300= 0.0038 g/l= 3,8 mg/l
donc 1*50/3,8= 13,165 litre
Où est mon erreur?
Merci d'avance!
salut!
Je viens de faire le calcul en utilisant la masse molaire de la trypsine bovine et j'obtiens 12.78 Litres.
Donc je ne vois pas d'où viens l’erreur si il y en a une
Re : Histoire de concentration
Merci!!
La concentration de l'article me paraît donc bien bizarre... car après je dois faire un rapport protéine inhibitrice:trypsine pour faire une courbe d'inhibition complète de 0 à 1.5 mole de ma proréine inhibitre par mole de trypsine.
Donc si c'est cette concentration là (0.163 µM) je dois prendre une mole de trypsine donc ça me fait (1/(0.163*10^-6)= 6134969 litre...
L'article me dit:" Inhibitory activity was assayed by incubating different amounts of "ma proteine" in water (final concentration ranging from 0 to 0.330 µM) with bovine trypsine (final concentration 0.163 µM prepared in 1 mM HCl) using DL-BAPNA as the subtrate at a final concentration of 1 mM." Donc je ne comprend pas pourquoi il a utilisé des concentrations aussi faibles et réussi à faire sa courbe c-à-d residual trypsine activity (%) en fonction de "ma protéine": trypsine in molar ratio...
J'ai acheté la trypsine, le subtrat et j'ai ma protéine et sur base de l'article je dois mettre au point mon test pour tester l'activité inhibitrice de ma proteine envers la trypsine mais je ne comprend pas pourquoi l'article utilise des concentrations aussi faibles... Ai-je loupé un truc?
Merci pour votre aide!
Bonjour,Envoyé par mailaure
Il n'est pas dit qu'il faut 1 mole de trypsine. Tu indiques un ratio molaire protéine/trypsine de 0-1.5, c'est un ratio, pas un nombre de moles. D'après l'article, tu dois préparer des solutions de ta protéine de concentration 0-330 µM et une solution de trypsine de concentration 0.163 µM. Par exemple, si tu veux 1 mole de protéine pour une mole de trypsine (ratio molaire de 1), il faut mettre un volume d'une solution de trypsine et un volume d'une solution de protéine pour que les quantités de matières dans chaque solution soient égales.
Dernière modification par Kemiste ; 02/03/2014 à 11h09.
Re : Histoire de concentration
Merci!
Au début c'est ce que je pensais mais on m'a donné un protocole et j'ai été un peu perdue avec la dernière phrase (cf rouge) parce ce que il ne parle plus de rapport molaire mais de mole:
Nous allons préparer une solution de trypsine bovine, d’absorbance d’environ 0,15 à 280 nm; dans du HCl 1mM (pour éviter l’autoprotéolyse).
Pratiquement :
100 µL trypsine
X µL de "ma protéine" d’absorbance Y à 280 nm (on peut commencer par un test où le rapport molaire "ma protéine":trypsine vaut 1,5 et vérifier qu’on inhibe la trypsine)
(1800-X) µL tampon d’activité*
préincubation 15 à 30min à 37°C
100µl DL-BAPNA 20mM (dans du DMSO)
Incubation Z§ min à 37°C
500 µL acide acétique 30% (pour arrêter la réaction enzymatique)
Lecture A410 nm
* Tris-HCl 50mM, Ca2+ 20mM, pH 8,2
§ : veiller à ce que l’absorbance à 410 nm n’excède pas 0,8 pour rester dans la zone linéaire.
Remarque :
Faire un contrôle positif (100% d’activité), c’est à dire un test sans "ma protéine".
Une fois que la capacité de "ma protéine" à inhiber la trypsine dans un rapport de 1,5 ait été vérifiée; vous pourrez alors établir une courbe d’inhibition complète, de 0 à 1,5 mole de "ma protéine" par mole de trypsine.
Donc je pensais p-e moins diluer la solution de départ pour essayer d'avoir directe des moles? car je trouve quand même bizarre de diluer autant...
Merci!!!
Dans la phrase en rouge, et comme je l'ai dit précédemment, il ne s'agit pas de moles mais d'un rapport molaire. Si tu as 1 mole de protéine par mole de trypsine tu as un rapport molaire de 1 et c'est la même chose que 0.1 µmol de protéine pour 0.1 µmol de trypsine ou 1.2589 mmol de protéine pour 1.2589 mmol de trypsine... Donc pas d'inquiétudes, les très faibles concentrations sont normales
Re : Histoire de concentration
OK merci pour ton aide c'est beaucoup plus claire
