mème concentration c-à-d mème chromatogramme
Salut,
je prépare un échantillon (dilution par l'Hexane) troi fois afin d'obtention des chromatogrammes d'un mème échantillon ( répétés trois fois), et lorsque je fais la superposition, je remarque que les pics sont très différents ( augmantés ou diminués) mais ont le mème temps de rétention, selon moi je trouve que normalement les pics ont les mèmes hauteurs comme je prépare la mème concentration à chaque fois, expliquez moi svp ?
merci d'avance
Dernière modification par papillon de mer ; 04/06/2014 à 18h53.
Bonsoir,
Je ne suis pas un expert, mais les pics ont-ils la même aire? L'aire des pics est plus significatif que la hauteur. Quand tu dis que les pics sont "très différents", qu'entends tu exactement? Il y a-t-il une grande variation de la largeur du pic? Le temps de rétention est-il exactement le même où as-tu quelques variations? Est-ce le même échantillon que tu dilues dans l'hexane et que tu injectes 3 fois où est-ce que tu prépares indépendamment 3 échantillons?
Dernière modification par Kemiste ; 04/06/2014 à 19h05.
je n'ai pas fait l'attention sur l'aire, je ne remarque que l'hauteurEnvoyé par Kemiste
même largeur du pic, même temps de rétention, oui biensur c'est le même échantillon, et je prépare indépendamment 3 échantillons afin d’éliminer l'erreur de préparationQuand tu dis que les pics sont "très différents", qu'entends tu exactement? Il y a-t-il une grande variation de la largeur du pic? Le temps de rétention est-il exactement le même où as-tu quelques variations? Est-ce le même échantillon que tu dilues dans l'hexane et que tu injectes 3 fois où est-ce que tu prépares indépendamment 3 échantillons?
En quoi sont-ils différents alors? Ce n'est que la hauteur du pic? Il y a-t-il une grande variation?
Ce n'est donc pas la même solution que tu injectes à chaque fois... Le problème vient peut être de là. Si tu prépares 3 solutions es-tu sûr qu'il n'y a pas d'erreur possible dans la préparation? As-tu essayé d'injection plusieurs fois la même solution?oui biensur c'est le même échantillon, et je prépare indépendamment 3 échantillons afin d’éliminer l'erreur de préparation
Dernière modification par Kemiste ; 04/06/2014 à 19h44.
demain je vais remarquer l'aire, mais pour le moment je me souviens que l'hauteur, oui il y a une variation importante
oui, je prépare avec précisionSi tu prépares 3 solutions es-tu sûr qu'il n'y a pas d'erreur possible dans la préparation?
oui, je le fais mais il reste le même problèmeAs-tu essayé d'injection plusieurs fois la même solution?
De quel ordre environ?
Je n'en doute pas!Mais une erreur peut arriver. L'injection de 2 solutions n'ayant pas exactement la même concentration aurait pu expliquer les variations.
Et une question que j'aurais du poser avant, quelle technique chromatographique utilises-tu? (Je ne sais pas pourquoi mais j'avais en tête l'HPLC mais en relisant je me suis rendu compte que tu n'avais pas précisé).
je ne fais pas le calcul mais si on compare par exemple entre les deux pics je remarque que le pic 1 est presque le demi de 2 picDe quel ordre environ?
oui, peut étreJe n'en doute pas! Mais une erreur peut arriver. L'injection de 2 solutions n'ayant pas exactement la même concentration aurait pu expliquer les variations.
j'utilise la CPG pour quantifier l'ester d'acide grasEt une question que j'aurais du poser avant, quelle technique chromatographique utilises-tu? (Je ne sais pas pourquoi mais j'avais en tête l'HPLC mais en relisant je me suis rendu compte que tu n'avais pas précisé).
Comment fais-tu tes injections? Il n'y a pas de problème possibles liés au système d'injection? (un problème au niveau du volume injecté?). Les solutions sont bien homogènes?
Ensuite je laisse les spécialistes de la CPG répondre, ils auront peut être plus plus d'idées.
Dernière modification par Kemiste ; 04/06/2014 à 20h31.
je prends 1uL au moyen d'un syringe et je l'injecte, je ne sais pas s'il y a de problème possibles liés au système d'injection.Comment fais-tu tes injections? Il n'y a pas de problème possibles liés au système d'injection? (un problème au niveau du volume injecté?).
s'agit-il la solution préparée ? si oui je la homogène bien avant de le prendre par le syringeLes solutions sont bien homogènes?
D'accord merci beaucoup pour votre réponse, mais est ce qu'il peut trouver les mèmes aires avec hauteurs différents ?Ensuite je laisse les spécialistes de la CPG répondre, ils auront peut être plus plus d'idées.
1µL c'est assez faible, peut être qu'il y a des variations liées aux volume injecté. (Oui je parlais bien de la solution que tu prépares).
Si tu as des pics de même largeur mais de hauteur différentes il y a des risques que les aires ne soient pas les mêmes.
Vas-tu utilisé ces données pour un étalonnage? Si oui tu pourrais peut être penser à une méthode avec un étalon interne pour pallier aux éventuels problèmes de variations de volumes.
non pas pour un étalonnage, je l'utilise pour quantifier les acides gras d'un huile et je veux répéter l'injection 3 fois au moins afin d'éviter les erreursVas-tu utilisé ces données pour un étalonnage? Si oui tu pourrais peut être penser à une méthode avec un étalon interne pour pallier aux éventuels problèmes de variations de volumes.
Tu ne veux pas quantifier alors? Quantifier = déterminer une quantité (et donc il faut préalablement réaliser un étalonnage).
Si tu veux juste déterminer la présence ou non de certains acide gras dans une huile et que tes injections sont reproductibles au niveau des temps de rétention, ce n'est pas grave si tu n'as pas la même aire à chaque injection pour tes échantillons témoins?
non, le but principal c'est la quantification mais y compris au même temps la qualification et concernant la quantification, il peut quantifier chaque composé à partir de sa aire.
alors il faut avoir la même aire à chaque injection pour des même échantillons
Tu vas donc bien devoir faire une courbe d'étalonnage pour avoir la relation entre l'aire et la concentration. J'en reviens à mon idée d'étalon interne
faire attention au split/splitless (la division)
qui se ressemble s'assemble (Homère)
c-à-d courbe d'étalonnage d'un même échantillon ?Tu vas donc bien devoir faire une courbe d'étalonnage pour avoir la relation entre l'aire et la concentration. J'en reviens à mon idée d'étalon interne
comment, j'ai pas compris ?
au niveau de l'injecteur, il existe une (option) qui influe sur le volume injecté de façon que:
si on utilise le mode splitless, tout le volume injecté passe dans la colonne
si on utilise le mode split, une partie qui va traverser la colonne et l'autre est éliminée (par exemple un split de 1/50ème veut dire que 1/50ème qui passe dans la colonne et le reste 49/50ème sera éliminé)
qui se ressemble s'assemble (Homère)
Si tu veux déterminer la concentration d'un acide gras dans un échantillon d'huile, il faut que tu connaisses la relation liant l'aire à la concentration. Pour cela il faut que tu prépares plusieurs échantillons (= étalons) de concentration connue (au minimum 3), que tu les injectes et que tu reporte sur un graphe les valeurs d'aire en fonction de la concentration. Tu obtiens ainsi ta courbe d'étalonnage (= une droite). Tu injectes ensuite ton échantillon à analyser, et tu reportes sur ta droite d'étalonnage la valeur de l'aire afin de déterminer la concentration. Si tu as plusieurs composés à quantifier, tu dois faire une courbe d'étalonnage pour chacun des composés
Dernière modification par Kemiste ; 05/06/2014 à 06h28.
comme à dit kemiste, la meilleure façon de quantification est l'étalonnage interne afin d'éviter les erreurs d'injections
si tu veux donner le pourcentage de chaque acide dans le mélange, la méthode de normalisation des aires peut etre utilisée
qui se ressemble s'assemble (Homère)
merci beaucoup kemiste et sfnsfn2 pour votre réponses.
Dans notre cas, j'ai plusieurs composés à quantifier, et je veux donner le pourcentage de chaque acide dans le mélange selon plusieurs articles mais mon problème est la répétition de l'injection pas la méthode !
autre question svp: je trouve dans un article que les résultats donnés ( the results given as means of five repetitions injected in duplicate) signifie quoi cet exprssion?
la traduction est la suivante :
les résultats donnés sont la moyenne de cinq injections réalisées en double
au total, ils ont donc dix injections
cordialement
Si je comprend bien, tu veux injecter une huile et déterminer le pourcentage de chaque acide dans cette huile? Si c'est bien ça ce n'est pas grave si tu n'injectes pas exactement le même volume à chaque fois. La proportion relative de chaque acide sera la même, quelque soit le volume injecté.
Si par contre tu aurais voulu déterminer la concentration absolue de chaque acide c'était bien un problème de méthode car tu n'as pas d'injections reproductibles. Il aurait fallu changer de méthode avec un étalon interne par exemple car même si tu as un problème de volume d'injection tu aurais (surement) eu des résultats reproductibles.
merci bien HarleyApril
oui, je veux injecter l'ester méthylique d'acide gras préparé à partir d'huile,
D'accord, la proportion relative c'est le rapport entre l'aire de chaque acide et la somme des aires des tous acides? si oui, est ce que si je fais le calcul de pourcentage de trois injection je les trouve le mème pourtant les hauteur sont pas les mème ?
merciiiiiiiiiiiiii beaucoup
Si tu injectes 2 fois ta solution et que dans le deuxième cas tu injectes un volume plus faible alors tous les pics des composés seront "plus faibles". Donc au final le pourcentage d'un pic sera toujours le même.
oui, c'est très clair, maintenant je peux continuer comme ça, mais j'avais une autre question svp: comment, je peux calculer la concentration absolue de chaque acide? et est ce que je peux le calculer sans étalon interne ?
merci merciiiiiiiiiiiiiii beaucoup pour l'explication
Dernière modification par papillon de mer ; 06/06/2014 à 22h36.
Si tu veux calculer la concentration, comme je l'ai déjà dit, il faut avant tout faire une courbe d'étalonnage. Comme tes injections se semblent pas reproductibles tu ne peux pas te fier seulement à l'aire de tes pics. C'est pour ça que je proposais une méthode avec un étalon interne. Il existe peut être d'autres méthodes.
Bonjour
Le problème est avant tout une conséquence du protocole utilisé : A part si on ne peut vraiment pas faire autrement on ne détermine jamais la concentration par la hauteur du pic, ni même par l'aire, mais par comparaison avec l'aire d'un composé supplémentaire que tu ajoutes dans le mélange. Si ton mélange contient par exemple 99% d’hexane et 1% d'un mélange d'acides gras il faut ajouter environ 0.1 à 1% d'un composé supplémentaire.
Ce composé devra avoir une température d'ébullition proche de tes acides, sans quoi le split va fortement modifier la composition de ce qui sera réellement entrainé dans la colonne. Il faut aussi qu'il se détache suffisamment des autres pics, et il ne doit pas réagir avec les autres composés.
Éventuellement il est possible de quantifier par facteur de réponse avec le pic d'hexane, mais si sa température d'ébullition est trop différente des composés que tu doses on en revient au même problème : La composition de ce qui entre dans la colonne est modifiée, et pas toujours d'autant.
Dernière modification par Boumako ; 06/06/2014 à 22h46.
D'accord, mais comment je peux calculer la concentration avec un étalon interne, je pense que j'ai besoin l'aire des pics aussi !
