Probléme de répétabilité et d'exactitude sur HPLC

[invite8cf48739]

Bonjour à tous, actuellement en charge du développement d'une méthode HPLC pour les ammoniums quaternaires, je me heurte à un problème dont je ne trouve pas la solution. Mon soucis concerne la répétabilité et l'exactitude de mes analyses sur un même échantillon:
J'analyse une même solution standard (la concentration est comprise dans le domaine de linéarité) dans 4 vials différemment, 3 injections par vials. L'aire de mon pic cible est la même pour les répétitions d'un même vial (erreur relative inférieure à 1% entre les injections) mais l'aire de mon pic est sensiblement différente entre mes 4 vials ( je peux avoir + de 10% à 15 % d'écart relatif entre mes vials pour la même solution). Ceci me prouve que le problème ne proviendrait pas de la boucle d'injection (20 ul) ni de la lampe UV car sinon toutes les analyses individuelles auraient une quantification sensiblement différente.
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J'ai pu remarqué que ce phénomène n'était pas propre à cette méthode des ammoniums quaternaires mais aussi observable sur les autres méthodes HPLV-UV en développement dans mon laboratoire ( différentes colonnes, phases mobiles, débits...). Du coup, ce soucis m'empêche de finaliser la validation de trois méthodes différentes car il influe directement sur mes résultats d'exactitude et de répétabilité. ( spécificité, linéarité et précision validées)

Voila, j'espère que quelqu'un aura une idée de réponse à ce problème car pour l'instant aucun professionnel de mon entourage n'a trouvé une explication sensée.

cordialement,
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[invite9c307283]

bonjour
il se peut que le problème concerne la mise en flacon (vial); le sertissage (premier point à vérifier), une homogénéité de l'échantillon, une différence de température entre la mise en flacon et l'injection il y a un certain nombres de possibilité suivant les solvants utilisés.
Il peut aussi y avoir le gag des réactions photochimiques dans l’échantillon(le soleil qui arrive sur le passeur d'échantillon) mais cela est peu probable avec des ammoniums quaternaire.
Pour orienter la recherche il serait possible de rajouter un étalon interne à la solution et de voir si le rapport du produit recherché et celui de l'étalon interne reste constant.
Bonne chasse l'on trouve parfois des causes à la limite du pensable.

[invite8cf48739]

Merci beaucoup pour cette réponse,
néanmoins j'ai déjà pris en compte l'hypothèse de l'échantillonnage mais mon solvant étant une solution tampon PBS (je vérifie que le pH soit constant) et les ammoniums quaternaires n'étant pas volatiles (très bonne solubilité dans l'eau), cette raison me semble peut probable. Par contre l'ajout d'un étalon interne à la solution me parait cohérent afin de voir si c'est un soucis indépendant de mon composé et des conditions d'analyse. Ce qui est surprenant c'est que je peux constater des écarts de 50% sur l'aire de mon analyte entre deux vials contenant exactement la même solution dans des conditions stables de température et de pression.

De toute manière, je reste motivé a trouver la solution!

[invite9c307283]

Bonjour
50% d’écart c'est énorme cela devrait faciliter la recherche.
Désolé mais le tampon PBS ne me dit rien?
L’échantillon est-il seulement dans une solution aqueuse de sels ou y a t'il un solvant de rajouté?
En concentrant la prise d'essai 10 fois et en variant le rapport solution aqueuse et solvant organique d'environ 20% l'échantillon peut-il formé deux phases? ou un précipité.

Remplissez vous tous les flacons au 3/4 (par exemple) et à la fin de la séquence leur niveau sont-il identiques?

Je suppose que vous utilisez un passeur et un injecteur automatique.
Avez-vous injecté 2 fois de suite la même série (aaabbb-aaabbb)? puis inversé les flacons échantillon de place et réinjecté? (bbb-aaa)

Apres avoir serti les flacons si l'on les mets te en bas y a t'il une fuite (je l'ai déjà vu avec une pince à sertir mal réglé).

[A voir en vidéo sur Futura]

[moco]

Moi je suggérerai une autre approche de ton problème. Est-ce que tu as une idée du risque d'adsorption de ton soluté sur les parois du récipient? Tous les récipients ne sont pas équivalents. Certains ont l'étrange capacité d'adsorber une plus ou moins grande quantité de soluté. Numérote tes flacons. Essaie de voir si ces écarts de mesure sont reliés au choix du flacon. On a eu vu de plus étranges écarts de comportement en matière d'effets de surface.