Répondre à la discussion
Affichage des résultats 1 à 8 sur 8

HPLC détermination de la composition de la phase mobile



  1. #1
    mariidiotee

    HPLC détermination de la composition de la phase mobile

    Bonsoir,
    je viens de réaliser une HPLC à polarité de phase inversée (= phase mobile polaire, et fixe apolaire).

    La première partie de ce TP était de déterminer quel proportion méthanol/eau je dois utiliser pour ma phase mobile pour obtenir des pices de mes analytes de caféines, théophylline et théobromine, bien distincts qui ne se chevauchent pas.

    Mes chromatogramme me montre que plus je met d'eau, meilleure est la séparation de mes pics.
    En clair la phase mobile 30%métahnol/70%eau est celle qui me donne le plus "beau" chromatogramme.

    Je sais que la séparation des différents analytes (caféine, théophylline et théobromine) provient des différences de la polarité respective de la phase mobile (polaire), de la phase stationnaire (apolaire) et des molécules à séparer, et que ici la phase mobile polaire, entraîne les composés polaires, donc l’analyte le plus polaire des 3 sortira en 1er.

    Question ? est-ce que le fait que mes pics se chevauche est dû au temps de rétention qui varie ?
    Si oui, cela veut dire que plus on met d'eau donc plus la phase mobile est polaire, plus mes analytes migrent vite et arrive vite au détecteur, mais comment ça permet de distancer les temps de rétention entre mes 3 produits ?

    J'ai un peu de mal a faire le lien entre la pratique et la théorie...
    Suis-je au moins sur la bonne route ou pas du tout ?

    Merci de vos réponses

    -----


  2. Publicité
  3. #2
    HarleyApril

    Re : HPLC détermination de la composition de la phase mobile

    Bonsoir

    Le fait que tes pics se chevauchent est dû au fait que tes molécules sont trop contentes d'être dans la phase mobile (temps de rétention court) ou dans la phase stationnaire (temps de rétention long).
    En faisant varier la composition de la phase mobile (tu pourrais jouer sur le type de colonne, mais c'est plus fastidieux) tu vas arriver à un mélange qui va être plus discriminant.

    Cordialement

  4. #3
    mariidiotee

    Re : HPLC détermination de la composition de la phase mobile

    Enfaite, j'en suis arrivé a la conclusion que plus il y avait d'eau dans ma phase mobile, plus les temps de rétention entre mes molécules était distinct:

    Composition de la phase mobile Caféine Théophylline Théobromine
    Temps de rétention ( en minute) m/e =30/70 4.1 2.92 2
    Temps de rétention (en minute) m/e =40/60 2,6 2,1 1,7
    Temps de rétention (en minute) m/e =50/50 2 1,8 1,6
    Temps de rétention (en minute) m/e =60/40 1,7 1,6 1,5

    mais qu'est ce que ça signifie :
    je ne comprend pas chimiquement parlant pourquoi plus ma phase mobile est polaire plus l'écart entre les temps de rétention augmente ?
    j'aurai pensé que les temps de rétention changeraient tous de la même façon et que l'écart resterait constant enfaite..
    Ça veut dire quoi ? quel est le rapport avec ma polarité ?
    je ne sais pas si vous comprenez ma question, c'est un peu flou dans ma tête..

  5. #4
    moco

    Re : HPLC détermination de la composition de la phase mobile

    Est-ce que ces résultats dépendent aussi du volume injecté ?

  6. #5
    mariidiotee

    Re : HPLC détermination de la composition de la phase mobile

    même volume : 20uL pour chaque,
    même débit : 0.8ml/min
    rien n'a changé, sauf la compo de la phase mobile

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    Sephiroth300

    Re : HPLC détermination de la composition de la phase mobile

    Bonjour,

    Déjà je tiens à te corriger, quand tu augmentes ta fraction en méthanol, tu diminues la polarité de ta phase mobile (l'eau est bien plus polaire).

    Quand tu diminues ta polarité, tu entraînes plus vite tes molécules qui sont relativement apolaires, par conséquent elles sortent plus rapidement de ta colonne. Elles sont toutes relativement impactées de la même façon par le changement de la phase stationnaire (relativement j'entends)

    Après ce n'est qu'une question de vitesse. Prenons un exemple très simple. 3 voitures doivent parcourir 100 km sur une autoroute. La première roule à 40km/h, la 2ème à 60km/h et la 3ème 100km/h. Petit calcul rapide, la première mettra 2.5 h, la deuxième 1.5 h environ et la 3ème 1 h. Elles arrivent dans des temps assez proches comme tu peux le voir.
    Maintenant tu dis à ces voitures de diviser leur vitesse par 2 (changement de phase stationnaire)
    La première roule maintenant à 20km/h, la 2ème à 30km/h et la 3ème 50km/h. Maintenant, la première mettra 5 h, la deuxième 3 h environ et la 3ème 2 h. Les écarts augmentent naturellement ! et ainsi de suite si on redivise la vitesse par 2, 1er : 10h, 2ème : 6h, 3ème 4h, les écart deviennent conséquents.
    C'est pourquoi en HPLC, on utilise toujours la phase stationnaire la plus "lente" (en terme de polarité j'entends) possible, mais suffisamment rapide pour que les temps d'analyse soient satisfaisants.

  9. Publicité
  10. #7
    mariidiotee

    Re : HPLC détermination de la composition de la phase mobile

    Merci beaucoup pour ta réponse ! Tu as tapé dans le mille ! J'ai bien compris !
    Oups je me suis trompé dans mon "tableau" c'est l'eau qui j'augmente..
    Ça veut dire donc dire qu'il faut que j'utilise une phase polaire comme les analytes que je veux identifier, mais la plus apolaire possible tout de même pour pouvoir bien les séparer?
    Merci beaucoup !

  11. #8
    Sephiroth300

    Re : HPLC détermination de la composition de la phase mobile

    On ne peut pas faire de généralité en terme de polarité, c'est pourquoi j'utilise le terme "vitesse".
    Dans ton cas tu as des molécules naturelles hétérocycliques, moyennement polaires. Le système de phase mobile que tu as donné correspond bien à ce genre de composés. En augmentant la polarité, tu améliores la séparation car tes composés interagiront moins avec ta phase mobile.

    Maintenant si les molécules que tu étudies sont très polaires (acides carboxyliques, alcools...), alors si tu augmentes la polarité de ta phase mobile, tu détériores la séparation car tes molécules sortiront toutes plus rapidement (cf mon exemple). Comme souvent, c'est l’expérience qui parle, et quand on change de familles de molécules on ne peux pas couper à un "screening" de phase mobile.

    Si tu as d'autres questions n'hésite pas

Sur le même thème :

Discussions similaires

  1. HPLC de la caféine - problème de phase mobile
    Par rackametal dans le forum Chimie
    Réponses: 0
    Dernier message: 19/01/2010, 11h59
  2. HPLC mise au point d'une phase mobile triazoles
    Par Jerg dans le forum Chimie
    Réponses: 0
    Dernier message: 22/04/2009, 13h49
  3. [Divers] Dégazage phase mobile HPLC
    Par aulie dans le forum Biologie
    Réponses: 9
    Dernier message: 19/03/2009, 10h51
  4. HPLC (Phase mobile)
    Par chrome VI dans le forum Chimie
    Réponses: 4
    Dernier message: 18/03/2009, 19h03
  5. polarité de molécule+phase mobile HPLC
    Par nouemie dans le forum Chimie
    Réponses: 3
    Dernier message: 27/02/2009, 14h28