HPLC détermination de la composition de la phase mobile

[mariidiotee]

Bonsoir,
je viens de réaliser une HPLC à polarité de phase inversée (= phase mobile polaire, et fixe apolaire).

La première partie de ce TP était de déterminer quel proportion méthanol/eau je dois utiliser pour ma phase mobile pour obtenir des pices de mes analytes de caféines, théophylline et théobromine, bien distincts qui ne se chevauchent pas.

Mes chromatogramme me montre que plus je met d'eau, meilleure est la séparation de mes pics.
En clair la phase mobile 30%métahnol/70%eau est celle qui me donne le plus "beau" chromatogramme.

Je sais que la séparation des différents analytes (caféine, théophylline et théobromine) provient des différences de la polarité respective de la phase mobile (polaire), de la phase stationnaire (apolaire) et des molécules à séparer, et que ici la phase mobile polaire, entraîne les composés polaires, donc l’analyte le plus polaire des 3 sortira en 1er.

Question ? est-ce que le fait que mes pics se chevauche est dû au temps de rétention qui varie ?
Si oui, cela veut dire que plus on met d'eau donc plus la phase mobile est polaire, plus mes analytes migrent vite et arrive vite au détecteur, mais comment ça permet de distancer les temps de rétention entre mes 3 produits ?

J'ai un peu de mal a faire le lien entre la pratique et la théorie...
Suis-je au moins sur la bonne route ou pas du tout ?

Merci de vos réponses
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[HarleyApril]

Bonsoir

Le fait que tes pics se chevauchent est dû au fait que tes molécules sont trop contentes d'être dans la phase mobile (temps de rétention court) ou dans la phase stationnaire (temps de rétention long).
En faisant varier la composition de la phase mobile (tu pourrais jouer sur le type de colonne, mais c'est plus fastidieux) tu vas arriver à un mélange qui va être plus discriminant.

Cordialement

[mariidiotee]

Enfaite, j'en suis arrivé a la conclusion que plus il y avait d'eau dans ma phase mobile, plus les temps de rétention entre mes molécules était distinct:

Composition de la phase mobile Caféine Théophylline Théobromine
Temps de rétention ( en minute) m/e =30/70 4.1 2.92 2
Temps de rétention (en minute) m/e =40/60 2,6 2,1 1,7
Temps de rétention (en minute) m/e =50/50 2 1,8 1,6
Temps de rétention (en minute) m/e =60/40 1,7 1,6 1,5

mais qu'est ce que ça signifie :
je ne comprend pas chimiquement parlant pourquoi plus ma phase mobile est polaire plus l'écart entre les temps de rétention augmente ?
j'aurai pensé que les temps de rétention changeraient tous de la même façon et que l'écart resterait constant enfaite..
Ça veut dire quoi ? quel est le rapport avec ma polarité ?
je ne sais pas si vous comprenez ma question, c'est un peu flou dans ma tête..

[moco]

Est-ce que ces résultats dépendent aussi du volume injecté ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[mariidiotee]

même volume : 20uL pour chaque,
même débit : 0.8ml/min
rien n'a changé, sauf la compo de la phase mobile

[Sephiroth300]

Bonjour,

Déjà je tiens à te corriger, quand tu augmentes ta fraction en méthanol, tu diminues la polarité de ta phase mobile (l'eau est bien plus polaire).

Quand tu diminues ta polarité, tu entraînes plus vite tes molécules qui sont relativement apolaires, par conséquent elles sortent plus rapidement de ta colonne. Elles sont toutes relativement impactées de la même façon par le changement de la phase stationnaire (relativement j'entends)

Après ce n'est qu'une question de vitesse. Prenons un exemple très simple. 3 voitures doivent parcourir 100 km sur une autoroute. La première roule à 40km/h, la 2ème à 60km/h et la 3ème 100km/h. Petit calcul rapide, la première mettra 2.5 h, la deuxième 1.5 h environ et la 3ème 1 h. Elles arrivent dans des temps assez proches comme tu peux le voir.
Maintenant tu dis à ces voitures de diviser leur vitesse par 2 (changement de phase stationnaire)
La première roule maintenant à 20km/h, la 2ème à 30km/h et la 3ème 50km/h. Maintenant, la première mettra 5 h, la deuxième 3 h environ et la 3ème 2 h. Les écarts augmentent naturellement ! et ainsi de suite si on redivise la vitesse par 2, 1er : 10h, 2ème : 6h, 3ème 4h, les écart deviennent conséquents.
C'est pourquoi en HPLC, on utilise toujours la phase stationnaire la plus "lente" (en terme de polarité j'entends) possible, mais suffisamment rapide pour que les temps d'analyse soient satisfaisants.

[mariidiotee]

Merci beaucoup pour ta réponse ! Tu as tapé dans le mille ! J'ai bien compris !
Oups je me suis trompé dans mon "tableau" c'est l'eau qui j'augmente..
Ça veut dire donc dire qu'il faut que j'utilise une phase polaire comme les analytes que je veux identifier, mais la plus apolaire possible tout de même pour pouvoir bien les séparer?
Merci beaucoup !

[Sephiroth300]

On ne peut pas faire de généralité en terme de polarité, c'est pourquoi j'utilise le terme "vitesse".
Dans ton cas tu as des molécules naturelles hétérocycliques, moyennement polaires. Le système de phase mobile que tu as donné correspond bien à ce genre de composés. En augmentant la polarité, tu améliores la séparation car tes composés interagiront moins avec ta phase mobile.

Maintenant si les molécules que tu étudies sont très polaires (acides carboxyliques, alcools...), alors si tu augmentes la polarité de ta phase mobile, tu détériores la séparation car tes molécules sortiront toutes plus rapidement (cf mon exemple). Comme souvent, c'est l’expérience qui parle, et quand on change de familles de molécules on ne peux pas couper à un "screening" de phase mobile.

Si tu as d'autres questions n'hésite pas