Dosage exact des protéines à 280 nm- Biochimie- Spectro

[invite06ecb5ec]

Bonjour à tous,
dans mon cours il est question de définir précisément la concentration de protéines en soustrayant les agrégats( avec mesure de l’absorption à 333 nm)

Avec cette notion, il y a une formule qui est l' absorbance de la protéine = absorbance à 280 - 2*Absorbance à 333 nm

Pourquoi multilie-t-on par 2? doit-on enlever cette diffraction avant et après la centrifugation ( reste des agrégats en solution)? mais alors dans ce cas on aurait 2* A 280nm aussi, alors pourquoi n est ce pas le cas?



Merci à ceux qui prendront le temps de me lire
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[moco]

Bonjour,
L'absorbance est le produit du coefficient d'extinction E, de la concentration C, et de la longueur L de solution parcourue par le rayon lumineux.
Admettons que la protéine soit en concentration C₁ et l'impureté en concentration C₂
J'appelle A1 l'absorbance de la seule protéine à 280 nm, puis E₁ le coefficient d'extinction de la protéine à 280 nm, et E₂ celui de l'impureté à 280 nm.
J'appelle A2 l'absorbance de la seule impureté à 280 nm, et A la somme des deux absorbances à 280 nm.
J'appelle E₁' le coefficient d'extinction de la protéine à 333 nm, et E₂' celui de l'impureté à 333 nm.
Il semble bien quel protéine n'absorbe pas à 333 nm, donc que E₁' = 0.

L'absorption totale mesurée à 280 nm vaut : A = A₁ + A₂ = E₁ C₁ L + E₂ C₂ L
L'absorption totale mesurée à 333 nm vaut : A' = E₂' C₂ L

Si l'expérience montre que E₂ = 2 E₂', on peut calculer la seule absorbance A₁ due à la protéine à 280 nM, en posant :

A - 2 A' = E₁ C₁ L + E₂ C₂ L - 2 E₂' C₂ L = E₁ C₁ L + 2 E₂' C₂ L - 2 E₂' C₂ L = E₁ C₁ L = A₁

C'est la relation que tu cherches à établir : A - 2 A' = A₁. Elle dépend du fait que E₂ = 2 E₂', qui est un fait expérimental qui se produit dans ce genre d'expérience. Mais cette égalité est un heureux hasard, qui permet de simplifier les calculs.

[invite06ecb5ec]

Merci beaucoup Moco d' avoir pris le temps de tout bien expliquer et détailler , c ' est incroyablement bien expliqué et si clair
Milles merci !