Chromatographie d'exclusion stérique

[Vinou123]

Bonjour à tous,

Je suis face à un protocole de chromatographie d'exclusion dans lequel on cherche à purifier le lysozyme de blanc d'oeuf.
Je comprends le principe de ce type de chromatographie mais je ne comprends pas à quoi sert l'utilisation du tampon dans lequel trempe le gel Sephadex.

Je vous met ici le protocole en question pour une que mes question soient plus représentatives:

MODE OPERATOIRE
Purification du lysozyme par filtration sur gel
Lorsque vous êtes prêts (tubes numérotés et rangés dans le portoir, blanc d’œuf et tampon frais à disposition avec les pipettes propres pour les prélever) : retirer la pince de la colonne, et laisser s’écouler le tampon en excès dans un bécher jusqu'à ce que le ménisque du liquide affleure à la surface du Sephadex. Replacer la pince. (ATTENTION : IL DOIT TOUJOURS RESTER DU LIQUIDE AU-DESSUS DU SEPHADEX !)
 Placer un premier tube gradué sous la colonne. Appliquer lentement (sans remuer le Sephadex) 1 ml de la solution de lysozyme. Retirer la pince et commencer à recueillir l’éluat dans le premier tube gradué. (ATTENTION : A PARTIR DE CE MOMENT, NE PAS INTERROMPRE L’ECOULEMENT JUSQU’A LA FIN DE LA CHROMATOGRAPHIE !)
 Laisser écouler le tampon jusqu'à ce que le ménisque du liquide approche la surface du Sephadex), puis appliquer immédiatement 2 ml de tampon frais.
 Laisser pénétrer cette charge de rinçage tout en continuant à recueillir l'éluat. Remplacer le tube sous la colonne chaque fois que le niveau du liquide dans le tube gradué atteint la graduation à 2 ml !
 Remplir la colonne de tampon d'élution sans remuer le Sephadex. (Continuer à recueillir l'éluat dans différents tubes, jusqu’à obtention de 15 fractions de 2 ml). Maintenir au plus haut le niveau de tampon dans la colonne par des ajoutes successives de tampon frais.
Une fois la chromatographie terminée, replacer la pince et remplir la colonne à l’aide de tampon. Veiller à MAINTENIR LE SEPHADEX SOUS TAMPON !

Quel est son rôle dans la chromatographie?
Pourquoi il faut absolument maintenir le gel sous tampon comme il l'est indiqué à plusieurs reprise dans le protocole?

Merci d'avance pour vos réponse!
-----

[vpharmaco]

Le lysozyme est un protéine très robuste. Néanmoins, par défaut, on manipule les protéines dans des solutions tamponnées, de façon à maintenir des conditions de pH et de force ionique dans lesquelles la protéine d'intérêt risque le moins d'être dénaturée ou de précipiter.
Le lysozyme est par ailleurs une enzyme donc l'activité enzymatique dépend fortement du pH/force ionique du tampon. Si une étape de mesure de l'activité enzymatique est prévue après la chromatographie, il est préférable d'éluer la protéine directement dans le tampon approprié plutôt que d'avoir à faire une étape d'échange de tampon après la colonne.

Comme pour toute chromatographie, si une colonne est portée à sec, le solvant d'élution est remplacé par de l'air, et il va se créer des chemins préférentiels dans la colonne qui vont fortement perturber le profil d'élution des composés.