simple curiosité: production de masse ?

[Bounoume]

Grâce au Net je sais presque tout sur les vaccins ....... sauf un petit détail:

une fois définies les gènes / protéines à répliquer, une fois le premier ADN/ARN ou virus fabriqué, comment ils sont reproduits en usine?

Pour Astra-Zeneca et Spoutnik: cellules de singe in vitro, et ensuite inactivation, ou sans inactivation terminale? OU sur de vrais singes???????
Pour la famille Moderna+ Pfizer: j' imagine une arn-polymérase arn dépendante recyclant les copie déjà produites? et quid de l' alternance des brins complémentaires? positif et négatifs? J' imagine aussi à partir d' ADN, par de gentilles levures en culture? Ou par une ARNpolymérase avec un ADN modèle? ou autrement ?
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[BrainMan]

Production industrielle probablement.

Currently, the process is implemented as solid-phase synthesis using phosphoramidite method and phosphoramidite building blocks derived from protected 2'-deoxynucleosides (dA, dC, dG, and T), ribonucleosides (A, C, G, and U), or chemically modified nucleosides, e.g. LNA or BNA. To obtain the desired oligonucleotide, the building blocks are sequentially coupled to the growing oligonucleotide chain in the order required by the sequence of the product (see Synthetic cycle below). The process has been fully automated since the late 1970s. Upon the completion of the chain assembly, the product is released from the solid phase to solution, deprotected, and collected. The occurrence of side reactions sets practical limits for the length of synthetic oligonucleotides (up to about 200 nucleotide residues) because the number of errors accumulates with the length of the oligonucleotide being synthesized.^[1] Products are often isolated by high-performance liquid chromatography (HPLC) to obtain the desired oligonucleotides in high purity. Typically, synthetic oligonucleotides are single-stranded DNA or RNA molecules around 15–25 bases in length.

https://en.wikipedia.org/wiki/Oligonucleotide_synthesis

Vous pouvez acheter les réactifs ici par exemple :
https://www.glenresearch.com/browse/ancillary-reagents

[MissJenny]

d'après ce que j'ai compris le gène est inséré dans un plasmide et ce plasmide est introduit dans E coli, qu'on n'a plus qu'à cultiver pour que le plasmide soit amplifié. Ensuite il est purifié puis le gène est transcrit en ARN sans intervention d'un microorganisme. Je suppose qu'on a ajouté un bout de séquence qui permettra au peptide produit par les cellules humaines de s'en extraire ou au moins d'être visible à leur surface.

[BrainMan]

d'après ce que j'ai compris le gène est inséré dans un plasmide et ce plasmide est introduit dans E coli, qu'on n'a plus qu'à cultiver pour que le plasmide soit amplifié. Ensuite il est purifié puis le gène est transcrit en ARN sans intervention d'un microorganisme. Je suppose qu'on a ajouté un bout de séquence qui permettra au peptide produit par les cellules humaines de s'en extraire ou au moins d'être visible à leur surface.

Çà a l'air simple dit comme ça...
Et j'imagine qu'on remplace à la fin l'Uracile par la 1-méthyl-3’-pseudouridylyle ?

Le système immunitaire est très actif contre les virus : les ARNm d’origine virale sont normalement détruits rapidement. Or, il a été découvert [2] que si l’uracile de l’ARNm est remplacé par une molécule proche, le système immunitaire est trompé.

Donc dans le vaccin BioNTech / Pfizer, chaque U a été remplacé par du 1-méthyl-3’-pseudouridylyle, noté Ψ : cette substitution permet donc de ne pas alerter notre système immunitaire, le Ψ est accepté comme un U normal par les mécanismes cellulaires !

https://pedagogie.ac-rennes.fr/spip.php?article5130

[A voir en vidéo sur Futura]

[MissJenny]

ah oui. du coup ils ont dû développer une ARN-polymérase spéciale.

[BrainMan]

ah oui. du coup ils ont dû développer une ARN-polymérase spéciale.

Ca m’étonnerait, mais bon j'en sais rien, j'ai rien trouvé à ce sujet..

J'avais pensé aussi au début qu'ils avaient pu employer des bactéries.... des souvenirs de la vieille école.
A mon avis le système avec ajout de réactifs est plus sécurisé, plus facile à employer et plus facilement "scalable" qu'avec les bactéries qu'il faut quand même modifier au préalable, faire croitre, vérifier que ça mute pas, que ça tombe pas malade etc etc.
Ça a l'air facile a faire comme ça pour quelques doses, mais pour des grosses quantités, c'est plus aléatoire.

[JPL]

C’est pourquoi dans la production industrielle il y a plus de brins d’ARN incomplets que dans les vaccins utilisés pour les études de phase 1, 2 et 3 pour des raisons de rendement de la purification et de temps. Ce n’est pas un problème parce que pour que cet ARN soit traduit en protéine spike il faut que le brin contienne un signal de début et un signal de fin. Ce défaut a été corrigé d’une façon qui me semble très acceptable en utilisant un vaccin plus concentré en ARN que pour les essais.

[Bounoume]

Production industrielle probablement.
https://en.wikipedia.org/wiki/Oligonucleotide_synthesis

OK.
Cependant, je crois avoir compris que, in fine, c' est le code génétique complet de la protéine S que reproduisent Pfizer et Moderna, et la protéine S qui est ajoutée dans l' Adénovirus de Oxford....
Est-ce bien ça?
Si oui, l' ADN/ARN codant est bien trop long pour être synthétisé nucléotide après nucléotide....

N' y aurait-il pas au contraire édition génétique (crisp-cas9 ou autre) pour insérer /remplacer certaine séquences [éventuellemnt, en cas de mutant à prendre en compte] ou pour refiler la totalité du gène au plasmide?

[JPL]

Non, c’est bien le code pour la protéine S uniquement. Pour avoir le code complet du virus cela serait impossible en production industrielle.

[Bounoume]

d'après ce que j'ai compris le gène est inséré dans un plasmide et ce plasmide est introduit dans E coli, qu'on n'a plus qu'à cultiver pour que le plasmide soit amplifié. Ensuite il est purifié puis le gène est transcrit en ARN sans intervention d'un microorganisme. Je suppose qu'on a ajouté un bout de séquence qui permettra au peptide produit par les cellules humaines de s'en extraire ou au moins d'être visible à leur surface.

Ainsi la production en masse du support du code vaccinal passe quand même ? par une culture bactérienne ( culture qui embarque le plasmide, bien sûr....).....
Ton vieux souvenir, il est encore valable, BrainMan......

Après, faut encore isoler la bête, transcrire ADN en ARN...... purifier, rajouter la fausse enveloppe....

Moins direct que cultiver le virus de la grippe sur embryons de poulet....

ps: pour les vaccins à adénovirus, quel est le support de culture du virus? Cellules? Animaux?

[JPL]

N’est-ce pas tout "simplement" une synthèse directe de l’ARN de la protéine S ? Je pose la question, je n’en sais rien.

[MissJenny]

j'ai compris que c'était l'ADN qui était amplifié (par les bactéries). Je ne sais pas pourquoi on utilise des bactéries plutôt que la PCR. Peut-être que les bactéries font moins d'erreurs de copie, ou bien c'est simplement moins cher.

[BrainMan]

j'ai compris que c'était l'ADN qui était amplifié (par les bactéries). Je ne sais pas pourquoi on utilise des bactéries plutôt que la PCR. Peut-être que les bactéries font moins d'erreurs de copie, ou bien c'est simplement moins cher.

J'y crois pas.
D'autant que je me souviens avoir vu a la télé une interview dans une usine Pfizer et on y voit juste des grosses cuves (après c'est sûr qu'on voit pas toute l'usine).
Maintenant, sans pouvoir présenter des sources fiables, je pense qu'on ne fait que présenter des opinions.
On alimente la théorie du complot...

[MissJenny]

J'y crois pas.

et pourquoi pas? Amplifier de l'ADN est une chose qu'on sait faire, alors qu'amplifier de l'ARN est plus compliqué. D'ailleurs les méthodes de séquençage de virus à ARN commencent par rétrotranscrire l'ARN en ADN.

et pourquoi théorie du complot? c'est juste une question de technologie, qui n'a pas d'impact sur le produit final.

[BrainMan]

Pourquoi ne pas employer des bactéries ? La difficulté de produire à grande échelle.

Quelles sont les questions auxquelles il faudra répondre ?

C'est la première fois qu'on se prépare à utiliser un vaccin ARN chez l'homme à grande échelle et de nombreuses questions se posent quant à la faisabilité, l'efficacité et la sécurité de cette technologie.
La faisabilité

La production des différents composants d'un vaccin ARN (avec son "principe actif", l'ARNm, les nanocapsules lipidiques, le milieu de dilution, les stabilisants éventuels), y compris en grande quantité, est un processus bien maitrisé.

Elle ne nécessite pas, à l'inverse de d'autres types de vaccins (vaccins inactivés, vaccins sous-unités préparés à partir de virus ou bactéries entiers), la culture d'agents pathogènes, imposant des équipements et des procédures très lourdes et des délais considérables.

D'importants investissements ont déjà été effectués par des industriels disposant du savoir-faire, qui sont en mesure de produire plusieurs millions de doses. Les contrôles de qualité sont également simples et bien standardisés, il ne sera pas nécessaire d'avoir recours à des mises en culture ou des inoculations à l'animal pour détecter un éventuel retour à la virulence.

https://www.mesvaccins.net/web/news/...ir-des-vaccins

et pourquoi théorie du complot? c'est juste une question de technologie, qui n'a pas d'impact sur le produit final.

Parce que concrètement, lorsque vous cherchez il n'y a rien (en tous cas j'ai rien trouvé de concret pour le moment) sur le production actuelle du vaccin à ARN.
Vous-même en êtes réduit à des conjectures.

Ce que j'ai de mieux c'est ça : Une photo et une société Lonza en Suisse.

Laboratoire Lonza où est produit le vaccin Moderna, à Viège (Suisse), le 29 septembre 2020. DENIS BALIBOUSE / REUTERS

https://www.lemonde.fr/economie/arti...9121_3234.html

Peut-être qu'un initié saurait tirer quelque-chose de la photo ?
(Pour moi en tous cas je n'y vois pas de culture bactérienne, mais je ne suis pas spécialiste)

Ah oui, et aussi, lorsque le petit frenchy est allé présenter son vaccin (qu'il avait déja...) à Donald Trump à la maison blanche, il lui avait fallu 42 jours pour le faire, en partant de la séquence décodée à Wuhan.

[MissJenny]

La machine qu'on voit sur la photo est un bioréacteur, qui sert à cultiver des bactéries.

[BrainMan]

La machine qu'on voit sur la photo est un bioréacteur, qui sert à cultiver des bactéries.

C'est un bon indice.
Ça veut dire que c'est pas comme ça qu'ils le fabriquent.

Après j'ai trouvé ça (pour ce que ça vaut à nouveau...).

Ces vaccins à ARNm sont créés par des procédés chimiques beaucoup plus rapides que les vaccins traditionnels, fabriqués par la culture de virus affaiblis dans des œufs de poule. Les fabricants partent d’une séquence numérique de composants génétiques pour la nouvelle protéine « spike » du coronavirus, que le pathogène utilise pour pénétrer et infecter les cellules.

Des chaînes de montage robotisées transforment cette séquence d’abord en un modèle d’ADN, puis en la substance du vaccin à ARNm.

Pour protéger l’ARNm, qui est très instable, les producteurs de vaccins l’emballent dans une nanoparticule lipidique huileuse qui facilite également l’absorption par les cellules humaines. De dimensions nanoscopiques (de l’ordre d’un dixième de millionième de mètre), l’enveloppe de ces nanoparticules est composée de deux lipides, un phospholipide et du cholestérol et se présente sous forme d’une membrane similaire à celle d’une cellule biologique anodine.

https://up-magazine.info/le-vivant/s...-vraie-galere/

Peut-être que tout ça est indiqué dans le brevet du vaccin, faudrait peut-être voir de ce côté.
(Parce que sinon on entend juste des gens "dire que").

[MissJenny]

voir ici : https://eu.usatoday.com/in-depth/new...se/4371693001/

ou ici : https://www.gov.uk/government/public...vid-19-vaccine (plus sérieux)

[BrainMan]

voir ici : https://eu.usatoday.com/in-depth/new...se/4371693001/

ou ici : https://www.gov.uk/government/public...vid-19-vaccine (plus sérieux)

Effectivement, là ça répond pleinement à la question de la production.

[Bounoume]

www.gov.uk/ The DNA template from which the RNA is transcribed is critical for the fidelity of the mRNA. The manufacture of the DNA template has been described. It is manufactured through fermentation in an established and well-controlled Escherichia coli cell line, extracted and purified. The specifications controlling the quality of the DNA template are satisfactory. Batch data for the DNA template have been supplied for several batches for which an acceptable level of batch to batch consistency is observed. The genealogy of the finished product can be traced back to the batch of originating DNA template.

The in vitro enzymatic RNA transcription process has been adequately described. The 5’cap and poly(A) tail are co-transcribed with the S1S2 spike protein codon. It is noted that the operating parameters for this process span a wide range however this does not raise any immediate concerns for the batch under review.

has been adequately described.: ... pour les détails, on ne saura pas ....... secret de fabrication...... tant pis.......

[BrainMan]

has been adequately described.: ... pour les détails, on ne saura pas ....... secret de fabrication...... tant pis.......

Oui, enfin bon c'est probablement de la production standard.
Ici, si je comprends bien (on corrigera si je me trompe), le but c'est de produire un maximum de plasmides (contenant le code ADN de la protéine spike (modifiée pour qu'elle ne nécessite pas de modification ultérieure)).
Le plus économique apparemment c'est bêtement de multiplier une lignée de bactéries modifiées (le plasmide contenant l'ensemble de leur code génétique + le code la protéine).
Derrière, j'imagine qu'ils broient et purifient par repérage de la masse via la migration dans une "cellulose" ou alors peut-être par centrifugation ou les deux, pour récupérer les plasmides (circulaires donc) qui ont donc tous la même taille (en Dalton).
Une fois purifié, on coupe avec des enzymes qui repèrent le signal de début et de fin du code de la protéine (qui a été également inséré à cet effet précédemment j'imagine)
On purifie a nouveau pour récupérer les seuls brins d'ADN codant pour la protéine.

Ensuite, on fait travailler une ARN polymérase pour générer de l'ARN en masse sur cette soupe de brins d'ADN. + Acides nucléiques, l'Uracile étant remplacé par un équivalent synthétique pour des raisons de sécurité et de conservation.

On purifie à nouveau pour ne conserver que les brins d'ARN (de bonne taille qui plus est).
Reste à mélanger cet ARN avec des micelles de lipide (là c'est surement du secret de fabrication).

On met tout ça à -70 et on envoi à l'usine de remplissage de flacons.

J'ai peut-être dit quelques conneries, mais les initiés pourront corriger les points douteux.