[Bio] [L2-L3]Développement du Xenope-VegT (NC)

[piwi]

Bonjour,

Je vous propose un exercice de biologie de développement de mon cru (énoncé en pièce jointe). Sa rédaction et son esprit s'inspire de l'exercice du second concours d'entrée aux ENS que j'ai déjà proposé ici ( http://forums.futura-sciences.com/thread157126.html ). Soyez imaginatifs et ca ne devrait pas être trop difficile.
Notez qu'une question nécessite d'avoir quelques connaissances de base du les récepteurs nucléaires.

J'espère que vous prendrez plaisir à le regarder voir même à y réflechir.

Cordialement,
piwi
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[piwi]

Pour la partie III il faut bien entendu mettre en relation les parties I et II et non pas II et III comme c'est ecrit.

Cordialement,
piwi

[invite3beef151]

Salut piwi

Je n'arrive pas à lire le dossier !! Snif

Si tu pouvais faire comme l'autre sujet du second concours de l'ENS, ça serait sympa !!

Merci d'avance

[piwi]

Puisqu'il semble que l'énoncé sous format word zippé soit difficile à ouvir je le reprends en plein texte.





Au travers de l’étude de la molécule VegT, on s’intéresse à la mise en place de l’endoderme et du mésoderme chez le xenope.


I. La molécule VegT
L’alpha amanitine est un inhibiteur de la transcription. Un traitement d’embryons juste après la fécondation avec une telle substance conduit à l’arrêt du développement embryonnaire au bout de 7h (environs 12 cycles de mitoses et 4 000 cellules). C’est ce qu’on appelle la transition mid blastulaire.
...1. Justifiez le terme transition.
VegT est un facteur de transcription à domaine T-Box. La chronologie de l’expression de l’ARNm codant pour cette protéine et son patron d’expression sont présentés ci-dessous (Figure 1).
...2. Analysez le document 1.A.
...3. Proposez une explication aux différentes observations que vous venez d’effectuer.
...4. Décrivez le patron d’expression de VegT. Justifiez le nom de cette protéine.
...5. Pourquoi utiliser des embryons albinos ?


Figure 1
(A) Northern blot VegT réalisé à partir d’ARN totaux prélevés à différents stades du développement. Egg : embryon 1 cellule ; 7-9 : blastula ; 11 : gastrula ; 15-18 : neurula ; 26 : têtard avec bourgeon de membre ; 38 : têtard
(B) hybridation in situ des ARNs VegT.sur des embryons albinos aux stades 3 à 5
En haut le pole animal, en bas le pole végétatif.

Des embryons au stade 2 cellules reçoivent une injection au pôle animal, soit d’ARNm synthétique quelconque, soit d’ARNm VegT. Au stade 8-9 des explants du pôle animal sont prélevés et cultivés jusqu’stade 11. Par hybridation in situ on marque un type cellulaire dont la distribution physiologique au stade 26 est illustrée en (C).


Figure 2
Hybridation in situ d’un ARNm spécifique d’un type cellulaire.
(C) Distribution physiologique au stade 26 du type cellulaire.
(D et E) explants au stade 11. (D) explants contrôles injectés avec un ARN quelconque. (E) explants injectés avec l’ARNm VegT.
...6. Quel est le type cellulaire marqué ?
...7. Proposez une fonction pour VegT


II. Spécification de l’endoderme.
Sox17est une molécule importante pour la formation de l’endoderme. Afin de démontrer une interaction entre VegT et Sox17 Un ARNm chimère est développé. Elle associe la protéine VegT au domaine de liaison des ligands du récepteur des glucocorticoïdes (VegTGR). Des explants de pôle animal traités avec cet ARNm sont prélevés au stade 9 et sont incubés avec de la cycloheximide avant de recevoir du dexamethasone, un analogue des glucocorticoïdes.

Figure 3
RT-PCR sox17 effectuée sur des explants de pole animal au stade 10.5 (moins d’une heure après le stade 9), sauf pour la colonne WE (embryon entier : whole embryo)
DEX : traitement au dexamethasone.
CHX : traitement à la cycloheximide.

...8. Expliquez le principe expérimental mis en œuvre ici pour montrer une interaction entre VegT et sox17.Notez que le fonctionnement du récepteur des glucocorticoïdes est analogue à celui du récepteur des oestrogènes.
...9. Analysez la figure 3
.10. Que concluez-vous ?


III. Induction du mésoderme.
En mettant en relation les parties I et les parties II, que pensez vous du rôle de l’endoderme dans la mise ne place du mésoderme ? Justifiez votre réponse.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite3beef151]

Merci beaucoup !!

J'essaierais de te faire part de mes trouvailles avant la fin de la semaine ...
Je vais voir ce qu'un ancien PCEM1 peut faire ... ... histoire de découvrir ce qui m'attend en L2 bio.

A bientôt

[piwi]

Bonjour,
Le temps à copieusement passé et il m'a été demandé de bien vouloir donner les réponses à cette exercice. L'expérience du groupe de révision étant terminée, j'ai plaisir à les indiquer dans ce message.

Voici des réponses aux questions de l'exercice.

1. transition mid blastulaire.
L’embryon peut se développer durant 7 heures sans que la transcription de son génome ne soit active. C'est-à-dire que durant cette période, le développement embryonnaire repose sur la transcription des ARN d’origine maternelle, déposés dans l’ovocyte. Passé 7 heures, pour que le développement se poursuive, il est nécessaire que le génome embryonnaire soit transcrit. La 7 ème heure constitue donc une transition dans la conduite du développement embryonnaire. Avant 7h il est contrôlé par les ARN d’origine maternelle, après 7h il est contrôlé par le génome embryonnaire.

2. Profil d’expression de VegT
La technique utilisée est le northern blot qui utilise une ribosonde marquée (radioactive) pour détecter un ARN spécifique complémentaire. Ici la cible est VegT que l’on cherche à détecter à plusieurs temps du développement embryonnaire. L’intensité de la bande révélée traduit la quantité de transcrits présents dans l’extrait analysé (pour réellement quantifier il aurait fallu l’analyse d’un ARN dont la quantité est estimée constante à tout moment du développement embryonnaire afin de s’assurer que l’on a bien le même taux de base en ARN dans chacun des extraits).
On peut constater qu’entre le début du développement embryonnaire et la 7ème heure, VegT est exprimé et sa quantité est constante dans l’embryon. A partir de la 7ème heure sa quantité augmente progressivement jusqu’à la 11ème heure où il commence à être moins exprimé. L’expression du gène est nulle à la 26ème heure de développement.

3. explications des observations.
La présence de VegT avant la transition mid blastulaire suggère qu’il a une origine maternelle. Passée cette transition, il est ensuite activement transcrit par l’embryon et ce que l’on détecte jusqu’à la 11ème heure sont les transcrits d’origine embryonnaires qui s’enrichissent dans les cellules. Ensuite, le gène VegT cesse d’être transcrit et la décroissance de son expression cellulaire reflète la dégradation progressive des transcrits.

4. patron d’expression de VegT
La technique d’hybridation in situ des ARNm codant pour VegT grâce à l’utilisation d’une ribosonde complémentaire marquée, montre que les transcrits sont concentrés exclusivement au pole végétatif de l’embryon de xenope. Le nom de la protéine apparait dés lors très clair : Veg pour pôle végétatif, T pour T-box, le motif protéique caractéristique de la protéine.

5. Pourquoi des embryons albinos ?
Les embryons de xenope présentent une pigmentation noire au pole animal. La présence de cette pigmentation abaisserait le contraste au cours du marquage de VegT par hybridation in situ. Il est plus parlant d’utiliser un embryon albinos.

6. Quel est le type cellulaire marqué ?
La protéine détectée n’est exprimée in vivo que dans somites qui trouvent leur origine dans le mésoderme (Fig C). L’injection de transcrits codant pour VegT entraine une prolifération des explants de pôles animal cultivés in vitro (on comparera la figure D et la figure E). L’hybridation in situ de la protéine mésenchymateuse détectée en Fig C, montre un marquage intense dans la zone de croissance (fig E). Ceci signifie que le tissu qui se développe est du mésoderme.

7. Rôle de VegT ?
VegT permet le développement du mésoderme.

8. Principe expérimental.
En couplant VegT au récepteur des glucocorticoïdes (GC), on asservit sa translocation nucléaire à la présence de GC. Ainsi, en absence de GC, la construction chimérique est séquestrée dans le cytoplasme. C’est uniquement après injection de GC qu’elle gagne le noyau où elle va pouvoir activer les gènes cibles de VegT. Le choix du stade 9h repose sur le fait qu’à ce moment, les ARN maternaux n’agissent plus et la transcription du génome embryonnaire est activée. L’inhibition de la synthèse protéique par la cycloheximide assure qu’il n’y a pas de protéine dont l’expression est activée par VegT qui irait secondairement activer le promoteur de Sox17b. Ainsi, en 1h, VegT a le temps d’être transloqué dans le noyau où il pourrait se fixer sur le promoteur du gène Sox17b pour en activer l’expression.

9. Analyse de la figure 3.
On voit qu’en absence de GC il n’y a pas d’expression du gène mésodermique Sox17b. En revanche une fois le produit administré il y a expression de Sox17b. Ceci signifie bien que VegT a gagné le noyau et c’est fixé sur le promoteur de Sox17b pour en activer la transcription.

10. Conclusion
Cette expérience démontre que VegT est epistatique à Sox17b.

VegT est un facteur de transcription exprimé dans l’endoderme primitif. On a vu qu’il contrôle l’expression de protéines telles que Sox17b. On a aussi vu que la présence de VegT dans les cellules du pole animal est suffisante pour induire la différenciation en mésoderme. Ainsi, on peut penser qu’au travers des protéines dont il contrôle l’expression, VegT permet d’induire la différenciation des cellules du pôle animal, au contact de l’endoderme primitif, en mésoderme. Ces expériences suggèrent que c’est l’endoderme qui contrôle la différenciation des cellules animales en mésoderme.



Cordialement,
piwi

[Elohir]

Très joli sujet: Félicitations!