bonjour,
j'expose mon probleme : apres une rt pcr, je fais migrer mes adn. un couple d'amorce par puits, donc normalement un seul trait visible sur le gel si la rt pcr a marché ou alors rien... mais là, j'obtiens plusieur bandes distinctes pour el meme puit. les amorces ne pouvant s'hybrider qu'a un seul endroit sur le genome, je ne comprend pas comment on peut obtenir plusieurs produits pcr avec un seul couple d'amorce.
les amorces ont été vérifiée, pas de conta....
pouvais vous m'aider?
La température d'hybridation est peut-être trop basse...
Jean-Luc
La violence est le dernier refuge de l'incompétence.
Salvor Hardin
J'aurais dis ça aussi... Souvent, si la température est trop basse, tu peux amplifier des choses pas spécifique.
Tu cherches à amplifier quoi ? un ARNm je suppose, mais ça provient d'un plasmide (transfection) ou c'est génomique ? Tu as blasté tes oligos sur le génome de ta bestiole pour voir si ya pas de possibilité d'amplifier autre chose ?
FX
je cherche a amplifier un cDNA fait a partir d'ARN. les deux amorses sont vraiment spécifique a cet endroit, je les ai blasté avant de l'utiliser. en gros je veu amplifier un cDNA de 700 bp a peu pres donc des oligo a chaque bout pour la pcr et normalement pas de probleme d'hybridation ailleurs que la...
comment jouerai la temperature? si c'etait sur l'appariement des deux amorces : dans ce cas on aurai pas d'amplification et donc pas de bandes, et encore moins de bandes multiples....
l arn extrait est issu d'une bacterie et devrai etre un ARNm...
SI ton ARN initial est extrait d'un tissu, ne peux-tu pas avoir des variants d'épissage, tout bêtement ? Dans ce cas tu aurais plusieurs ADNc suite à la RT.
Mais si tu utilises une température trop basse, tu peux amplifier des séquences avec erreur, il suffit qu'une des deux amorces se fixe un peu plus loin et hop.
Jean-Luc
La violence est le dernier refuge de l'incompétence.
Salvor Hardin
c'est une bacterie!! donc pas d'epissage alternatif
Salut,
elles sont a quelles tailles tes bandes non desirees?
A+
On pourrait avoir le scan du gel pour voir a quoi ca ressemble ?
Yoyo
