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Questions relatives à la PCR



  1. #1
    haleckx

    Questions relatives à la PCR

    Voilà, lors d'une expérience très simple, j'ai procédé à la détection de la séquence Alu par PCR pour différentes personnes. Je voulais savoir quelles seraient les raisons qui expliquent l'obtention d'une très faible quantité de produits de PCR après amplification ?... Autre question à propos du PCR: est-ce que la région amplifiée par PCR inclut les amorces? J'attends vos réponses ! Merci !

    -----


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  3. #2
    MaliciaR

    Re : Questions relatives au PCR

    Salut,

    Aux dernières nouvelles, personne ici n'a de boule de cristal fonctionnelle. Donc, si tu ne donnes pas plus de détails techniques, on ne pourra pas t'être d'une grande aide.
    An expert is one who knows more and more about less and less.

  4. #3
    Josquin

    Re : Questions relatives au PCR

    Citation Envoyé par haleckx Voir le message
    Autre question à propos du PCR: est-ce que la région amplifiée par PCR inclut les amorces? J'attends vos réponses ! Merci !
    Fais-toi (ou trouve-toi) un schéma explicatif de la PCR (on dit "la" PCR en général), et tu verras tout naturellement que les amorces sont bien intégrées à la séquence amplifiée : c'est là dessus que se base la méthode.

    Pour ce qui est de ton problème, plusieurs possibilités :
    - les amorces sont elles bien spécifiques ?
    - la température d'hybridation est-elle respectée ?
    - le nombre de cycles ?
    - pour être sûr que c'est la bonne séquence qui a été amplifiée, l'idéal serait de la faire séquencer.

    Josquin

  5. #4
    haleckx

    Re : Questions relatives au PCR

    Les séquences Alu sont des fragments d'ADN d'environ 300 pb qui sont mobiles dans le génome humain. On y retrouve un site de restriction Alul (d'où leur nom). Certaines personnes possèdent la séquence Alu; d'autres non. L'expérience en question impliquait que plusieurs personnes effectuaient un rincage de leur bouche (pour aller recueillir de l'ADN) avec de l'eau saline et crachait dans un tube qui était ensuite centrifuger. Je recueillais ensuite ces cellules pour amplifier les séquences Alu présentent et pour déterminer ensuite, par électrophorèse, la proportion d'individus présentant ou non la séquence Alu dans leur génome.

    Ainsi, je reformule: Lors d'une détection de la séquence Alu, qu'est-ce qui pourrait expliqué que j'obtienne une très faible quantité de produits PCR après amplification. La question ne se limite pas à cette expérience. Ce que je veux savoir c'est:
    - Qu'est ce qui explique qu'après amplification au PCR j'obtienne des bandes très faibles par rapport à la majorité ?
    - Question technique: est-ce que l'amplification par PCR inclu les amorces ou seulement la région entre les amorces ?

    Merci !

  6. #5
    haleckx

    Re : Questions relatives au PCR

    Merci Josquin pour la réponse concernant les amorces. Pour le problèm, toutefois, toutes les conditions étaient respectées puisque l'expérience à permit d'obtenir des bandes dont la taille était attendue. Toutefois, j'aimerais savoir pourquoi certaines bandes sont moins intenses après amplification.

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    Moumoutte

    Re : Questions relatives au PCR

    Bonjour,

    Citation Envoyé par haleckx Voir le message
    Je recueillais ensuite ces cellules pour amplifier les séquences Alu
    je suppose donc tu as réalisé une extraction ADN après avoir recueilli les cellules.
    As-tu bien récupérer l'ADN? L'extraction a-t-elle marché? L'ADN est-il dégradé? A-t-il été bien conservé?

    Cordialement

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  10. #7
    MaliciaR

    Re : Questions relatives au PCR

    Salut,

    je ne sais pas pourquoi, mais j'ai l'impression qu'il s'agit d'un TD
    Tu ne dis pas ce que tu amplifies exactement et quels sont tes contrôles, tu ne dis pas si une quantification à titre informatif a été faite avant la PCR,...


    Citation Envoyé par haleckx Voir le message
    Les séquences Alu sont des fragments d'ADN d'environ 300 pb qui sont mobiles dans le génome humain. On y retrouve un site de restriction Alul (d'où leur nom). Certaines personnes possèdent la séquence Alu; d'autres non.

    (...)

    - Qu'est ce qui explique qu'après amplification au PCR j'obtienne des bandes très faibles par rapport à la majorité ?
    Perso, je trouve que tu as ta réponse : si tu as une quantité très faible de séquences Alu dans le génome par rapport à sa taille globale, comment veux-tu que sa proportion augmente miraculeusement...? Ou je n'ai pas bien compris ton truc, ou quelque chose m'échappe...


    déterminer ensuite, par électrophorèse, la proportion d'individus présentant ou non la séquence Alu dans leur génome.
    Euh, j'ai une autre question : les Alu sont des éléments répétés (les éléments mobiles les plus représentés dans le génome humain...). Comment veux-tu estimer la proportion d'individus les possédant ou non par une simple électrophorèse?


    Lors d'une détection de la séquence Alu, qu'est-ce qui pourrait expliqué que j'obtienne une très faible quantité de produits PCR après amplification.
    Beaucoup de choses. Regarde les posts de Josquin et Moumoutte plus haut et vérifie attentivement tout ça. Mais personne ici ne te donnera une réponse toute faite, la réflexion te revient
    An expert is one who knows more and more about less and less.

  11. #8
    haleckx

    Re : Questions relatives au PCR

    Merci pour vos réponses. J'avoue ne pas avoir été très clair dans mes propos, mais ma seule question était de savoir ce qui peut expliquer une très faible quantité de produits PCR après amplification. Je crois maintenant connaitre quelques raisons.

    Simplement pour vous expliquer le protocole: je devais d'Abord isoler l'ADN de quelques potes (et moins potes héhé) à partir de cellules buccales. J'utilisais ensuite du chelex pour absorber les produits de lyse cellulaire pouvant inerférer avec le processus d'amplification du PCR. Je vous évites tous les détails qui m'ont ensuite mener à effectuer la réaction PCR en utilisant les amorces oligo plat A (en amont) et oligo plat B (en aval) ainsi que la taq polymérase... bien sur. Après les cycles, j'analysais les produits PCR sur un gel d'agarose et tra-la-la... La détection s'effectuait dans le gène TPA. Sur le gel, une bande de 570 pb impliquait un individu homozygote (+/+) de ,Insert Alu dans le gène TPA, une bande de 260 pb impliquait un individu homozygote (-/-) et 2 bandes (570 et 260) impliquait un individu hétérozygote (+/-).

    Alors voila! Merci de votra aide!

  12. #9
    Moumoutte

    Re : Questions relatives au PCR

    Bonsoir,

    Citation Envoyé par MaliciaR Voir le message
    tu ne dis pas si une quantification à titre informatif a été faite avant la PCR,...
    Effectivement as-tu bien dosé ton matériel avant? Peut-être n'as-tu pas mis assez d'ADN dans ton tube pour pouvoir amplifier correctement.

    Citation Envoyé par haleckx Voir le message
    Je crois maintenant connaitre quelques raisons
    Et donc? ça nous intéresserait de savoir si tu as trouvé ton erreur. ça pourrait peut être nous éviter aussi de la reproduire par la suite

    +

  13. #10
    marine de la valla

    Re : Questions relatives au PCR

    la PCR c'est bien mais c'est pas parfait! en faisant varier légèrement la température ou le nombre de cycles tu pourras peut etre intensifié tes bandes. tu peux peut etre notamment vérifier la température d'hybridation de tes amorces...

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