PCR ou RT-PCR

[invited1cf8fc4]

Bonjour,

je travaille actuellement à l'élaboration d'un protocole pour l'identification d'un ou de gène(s) codant pour des récepteurs aux androgènes de types vertébré chez une espèce planctonique.
Bien que je comprenne les principes de la PCR et de la RT-PCR (reverse transcriptase). Je n'arrive pas à comprendre qu'elle est la différence entre ces deux techniques en terme de résultats obtenus, ni si l'une doit être choisie préférentiellement à l'autre et surtout pourquoi.
Et également qu'elle sont les prérequis matériels pour ces deux techniques (séquence d'interêt connue pour PCR et RT-PCR?, séquençage denovo?)
N'ayant jamais pratiqué, je n'arrive pas à avoir une vision claire et à choisir entre ces deux techniques.

Je vous remercie d'avance pour votre aide

A bientot.
-----

[Flyingbike]

En fait la PCR est une technique générale qui permet d'amplifier un acide nucléique de façon spécifique ou non. La RT-PCR (tu parles bien de reverse transcriptase et non de real time ??) est un peu a part pour plusieurs raisons :
-la matrice est un ARN
-il n'y a généralement qu'un cycle d'amplification, c'est à dire que tu obtiens autant d'ADN que tu n'as d'ARN dans ton tube

La RT est donc utilisée pour obtentir des ADNc complémentaires des ARN que tu as utilisés comme matrice. Ces ADNc peuvent ensuite être utilisés comme matrice dans d'autres types de PCR pour par exemple quantifier un certain ARN.

La RT n'est pas forcément spécifique : par exemple, tu veux quantifier un ARN particulier dans un tissu. Pour ça, tu fais une RT avec les ARN extraits de ce tissu avec des amorces aléatoires, tu obtiens donc des ADNc correspondant à tous tes ARN. Ensuite tu peux amplifier par PCR une région spécifique en utilisant des amorces spécifiques.

Je ne vais pas m'étaler trop, je préfère que tu me dises si ce que j'ai écrit commence a répondre a tes questions et si tu veux des précisions sur quelque chose.

[piwi]

-il n'y a généralement qu'un cycle d'amplification, c'est à dire que tu obtiens autant d'ADN que tu n'as d'ARN dans ton tube

Pourquoi? Ne faites vous pas un amalgame avec la reverse transcription?

La PCR amplifie des séquences d'acide nucléique. Dans l'immense majorité des cas, quand on parle de PCR on sous entend que on l'effectue à partir d'une matrice ADN.
La RT-PCR se fait à partir d'une matrice ARN. C'est à dire que le résultat dépend de l'expression du gène étudié dans le tissu analysé. Elle suppose une phase de reverse transcription pour produire un ADNc à partir des ARN. Cette phase est aspécifique, vous transformez l'ensemble des ARN. Dans un second temps on réalise une PCR en prenant pour matrice ces ADNc produits.

Dans tous les cas, la spécificité de PCR dépend des conditions de PCR ainsi que du choix des oligonucléotides (séquence choisie, position sur la cible).

Cordialement,
piwi

[invited1cf8fc4]

Tout d'abord je vous remercie Flyngbike et Piwi pour vos réponses si rapide et très utiles.

Pour vous répondre Flyngbike, oui votre réponse m'aide à y voir plus clair. Et en parlant de RT-PCR oui je parle bien de Reverse transciptase.

Si j'ai bien compris si je connais déjà la séquence que je veux amplifier (séquence d'un récepteurs à androgène) et si je possède déjà les primers correspondants, je n'ai pas besoin de passer par l'étape de RT?

Mais dans les deux techniques si les primers que j'utilise pour la phase d'amplification (PCR) ne sont pas les bons je n'aurai pas d'information pour mon gène codant pour mon récepteurs. Mais si je fais une RT-PCR j'aurai au moins les ADNc complèmentaires que je pourrais stocker n'est ce pas, mais aucune autre information?

En ce qui concerne mes manipulations elles se feront sur des organismes entier étant donné qu'ils sont microscopiques. Dans ce cas la quantification sera inutile c'est bien ça?.

Je m'excuse si mes questions ne sont pas claires et ciblées mais je n'arrive pas à trouver des articles ou info qui me paraissent assez claires et complètes.

Encore merci

[A voir en vidéo sur Futura]

[Flyingbike]

PIWI : non je ne fais pas l'amalgame, Chicca514 parlait bien de la reverse transcriptase. Petite précision : la reverse transcriptase peut être spécifique, seulement ça n'a pas d'intérêt dans la plupart des cas.

Chicca514 : si tu veux amplifier de l'ADN génomique, tu n'as pas besoin de RT. Si tu veux amplifier des messagers, tu DOIS passer par une RT puisque la PCR utilise une matrice ADN. Si tu fais une RT tu auras en effet des ADNc a stocker et pas plus, mais par la suite tu pourras les utiliser en PCR pour amplifier ce que tu veux.

Quel est le but de ton protocole ? je ne comprends pas très bien. TU veux quantifer un messager codant pour ton récepteur ? tu veux déterminer la séquence d'un récepteur ?

[invited1cf8fc4]

En fait l'expérience que je veux faire doit me dire si oui ou non j'ai un gène ou des gènes qui code(nt) pour un récepteur aux androgènes dans mon organisme qui est un rotifère, à ce niveau-ci je n'ai pas besoin ni de le situer, ni de le quantifier. Je ne sais pas si je réponds à votre question. (c'est vrai qu'en me relisant je dis que j'ai besoin d'un gène, il est donc peut-être inutile de lancer une RT).

En fait je ne comprenais pas très bien si l'étape de RT était nécessaire pour obtenir mon gène et si je l'obtiens mon gène est ce que avec la RT-PCR j'aurais eu des informations supplémentaires qu'avec la PCR. Mais si j'ai bien compris
c'est quand on veut quantifier les ARNm et les situer dans un tissu qu'on utilise la RT.

[kamor]

La PCR amplifie une séquence d'ADN donnée grâce à deux amorces définies, autrement dit elle a une valeur d'identification =si les amorces s'hybrident et si l'amplicon qu'on obtient à la bonne taille, dans ce cas, c'est qu'on a ce qu'on veut dans le tube. Ca permet donc de savoir que dans l'échantillon il y avait notre cellule ou notre gène.
Mais ce n'est que de l'ADN, ça n'inclue pas que la cellule soit vivante ou qu'elle soit vivante et qu'elle exprime ce gène. C'est pour ça qu'on fait une RT-PCR, ainsi on sait qu'il y a transcription donc activité de la cellule. Je rappelle que ce n'est pas forcément une preuve qu'il y a traduction par la suite.
Il faut quand même savoir côté manip
- que l'extraction d'ARN est plus lourde (plus fragile, les RNases sont pratiquement impossible à inhiber complètement) que l'extraction d'ADN. Et plus chère il faut du matériel plutôt spécifique pour être sur de réussir.
- qu'il vous faut 3 amorces spécifiques (pas obligatoire, on peut utiliser des amorces universelles pour la RT mais bon)

[Flyingbike]

Tu veux voir si un gène connu s'exprime ou tu ne sais pas si un tel gène existe chez cette bestiole ?

L'approche n'est pas la même dans les deux cas.

[invited1cf8fc4]

Cette question m'aide énormément . Par moi même je n'y arrive pas en effet.

On sait chez une espèce proche que ce gène existe, mais dans ma bestiole on ne sait pas si il existe aussi.

Si je fais la RT j'aurai donc les deux informations d'un coup? si ma bestiole le possède et si elle l'exprime?

Merci kamor pour l'approche avantages/inconvénients des techniques.

[piwi]

PIWI : non je ne fais pas l'amalgame, Chicca514 parlait bien de la reverse transcriptase. Petite précision : la reverse transcriptase peut être spécifique, seulement ça n'a pas d'intérêt dans la plupart des cas.

Je ne voudrais pas chicaner, mais il était question de RT-PCR et non pas de RT. Si on fait seulement une RT il n'y a pas de cycle d'amplification du tout.

On peut faire une RT spécifique mais je ne vois vraiment pas l'intérêt. Dans tous les cas que j'ai rencontré les personnes, ou moi même, avons utilisés une RT avec des random primers et des polyT.

Pour rebondir là dessus je ne vois pas non plus d'où sort l'assertion qu'il faut trois oligos pour faire une RT.

Sinon quant au coût et à la difficulté d'extraire de l'ARN, là encore j'ai du mal. Pour extraire de l'ARN il suffit d'avoir du trizol, du chloroforme, de l'isopropanol, de l'ethanol et une centri réfrigérée. Le trizol était cher pendant un moment mais maintenant il est meilleurs marché. Question procédure, ça ressemble à une bête extraction d'ADN phénol/chloroforme. Rien de bien méchant là dedans.

[invited1cf8fc4]

C'est vrai que je parle toujours de RT mais je parle bien de l'étape de RT qui sera bien sur suivie d'une PCR.

Si j'utilise des primers spécifiques du récepteurs à androgène des vertébrés par exemple et que le gène du récepteur est présent chez ma bestiole la PCR me le dira.
Si maintenant je veux savoir si mon gène est actif (exprimé) dans l'organisme la phase de RT précédant la PCR m'aidera à le dire. Les primers pour la PCR (que ce soit pour la PCR ou la RT-PCR) seront dans les deux cas les mêmes...

En me relisant, je vois bien que mes questions sont un peu basiques voire
" bêtes", désolé. Ce sont souvent des étapes obligées chez moi pour arriver à comprendre .
Mais je vous remercie tous en tout cas pour votre rapidité et tout ce topic m'aide énormément.

[LXR]

En me relisant, je vois bien que mes questions sont un peu basiques voire
" bêtes", désolé

Aucune question n'est bête, seules les réponses peuvent l'être.

Greg

[kamor]

C'est moi qui ai dit qu'il fallait 3 amorces spécifiques pour une RT-PCR, car étant bête et méchant j'ai lu le premier post où il est question de RT-PCR.
J'ai fait de la RT-PCR et j'ai toujours utilisé des amorces spécifiques pour la RT, pour une raison toute simple, mon milieu était complexe, si je pouvais "supprimer" une partie des ARN présents dans mon échantillon et avoir donc moins d'ADNc interférents par la suite, on s'en portait bien mieux. Et j'ai bien précisé qu'on pouvait utiliser des amorces universelles, tout dépend du contexte.
Et l'extraction, faut être RNase free (la blague), vous travaillez toujours dans de la glace, ne pouvez pas utiliser de la bête eau distillée, faut mieux avoir de l'eau avec DEPC, si vous voulez avoir moins de dégradation, mieux vaut avoir un jeu de pipettes dédié à cela, une centri à froid pour inhiber au max, changer de gants régulièrement ...
Vous n'avez jamais remarqué une dégradation plus rapide des ARNm? A ma connaissance, à part chez les moisissures où l'ARN 16S apparait fréquemment sur les électrophorèses d'ADN, c'est TOUJOURS plus compliquée à extraire et conserver intact.

[Flyingbike]

kamor : j'ai du extraire quelques centaines d'ARN différents, j'ai jamais eu de dégradation. J'utilise de l'eau autoclavée et je les mets même au bain marie pour les resuspendre à la fin. Tout dépend du tissu. Par exemple des ARN de pancréas total, c'est plus tendu.

piwi : RT il n'y a pas vraiment d'amplification mais quand même une polymérase, la confusion entre reeverse transcriptase et real time sème vraiment le doute des fois...

Chicca :
si tu veux voir une expression sous forme de messager :
-extraction des ARN
-RT aspécifique
-PCR sur les ADNc avec des primers spécifiques

si tu veux déterminer la présence d'un gène
-extraction d'ADN
-PCR avec primers spécifiques.

Si tu ne sais pas si ton gène est présent il faudra essayer d'utiliser des primers dans une région conservée du récepteur aux androgènes. Mais l'absence de résultat ne voudra pas dire qu'il n'y en a pas...

Dans quel cadre tu réalises cette étude ?

[kamor]

Je l'avoue, mes extractions se sont toujours réalisées sur matrice complexe (selles humaines et joyeusetés dans le genre), mais même en culture pure pour la mise au point, j'ai remarqué de belles différences dans les concentrations obtenues, c'est pourquoi je lui recommandais de prendre plus de précautions qu'une "simple"extraction d'ADN (et une centri réfrigérée, c'est plus chère qu'une centri non réfrigérée aux dernières nouvelles, et il y a encore des labo qui n'en ont pas). Cela dépend aussi de la fréquentation de votre labo peut être.

Pour en revenir à la question de chicca, pour répondre à votre problématique telle que vous l'avez expliquée "En fait l'expérience que je veux faire doit me dire si oui ou non j'ai un gène ou des gènes qui code(nt) pour un récepteur aux androgènes dans mon organisme qui est un rotifère, à ce niveau-ci je n'ai pas besoin ni de le situer, ni de le quantifier." et que vous dites qu'il existe des amorces.
une PCR suffit pour répondre à cette question, si ce sont des gènes conservées, une réponse négative peut indiquer que les séquences d'hybridation des amorces sur l'ADN de votre organisme sont différentes sans pour autant rendre le gène ou la protéine inactif

[invited1cf8fc4]

ces deux dernières réponses me parlent...

En effet les amorces sont faites à partir de régions conservées que l'on espère retrouver chez cette espèce. Si ca ne marche ben "Aïe". Mais bon on tente.

Et Avec vos réponses je pense que je vais opter pour la RT-PCR, parceque comme vous me l'avez précisé la PCR toute seule ne va pas prouver que le gène est actif (si tjs gène il y a), à la base du projet son activité devait être prouvée par d'autre manips mais en fin de compte si les 2 techniques aux niveaux financiers ne sont pas fort différentes, et que tout compte fait les manipulations sont en générales toutes les deux assez efficaces, les informations de la RT-PCR seront complémentaires et toujours la bienvenue.


En tout cas je vous remercie du fond du coeur. Je lisais souvent les topics de ce forum et j'ai toujours trouvé des réponses à mes questions mais je ne m'étais jamais inscrite.
J'ai sauté le pas aujourd'hui Et je n'espérais pas avoir autant de réponses si vite .

Merci

[invitef08e6467]

Arfff j'arrive trop tard!!! pour une fois que j'avais la réponse à une question... comme on dit la culture c'est comme la confiture, moins on en a et plus on l'étale...

Du coup pour résumer la Pcr te donne l'info sur la présence au niveau génomique, la RT-PCR au niveau transcriptomique, et si tu veux aller plus loin il te faudra découvrir si l'ARn est bien traduit.

Par contre la RT-PCR est bien plus délicate que la PCR classique... Tout d'abord tu vas devoir travailler sur des ARNs qui sont très instables et tu devras faire preuve de délicatesse. Ensuite la reverse transcription est une étape cruciale car si elle foire!!!
Enfin si ton gène ne s'exprime qu'a certains moment du cycle de vie de ton organisme (développement, déclanchement par un stimulus...) il se peut que tu ne le détecte pas... Pour tout celà je te conseillerais de commencer par une PCR classique sur ADN extrait.

De plus, si je ne me trompe pas tu pourras utiliser les même primers pour ta PCR sur ADNC si tu passe à la RT-PCR par la suite...

Voila. Bonne chance.

[invited1cf8fc4]

Merci ... Il n'est jamais trop tard
Pour ce qui est des moments d'expression je compte réaliser plusieurs RT-PCR à différents stades du cycle de vie.

[kamor]

La question que tu te poses est " y a t'il le gène?" je tenterais d'y répondre d'abord par la PCR. Après éventuellement si tu prouves la présence du gène, tu peux t'intéresser à sa transcription avec tous les problèmes (possibles ou non) décrits au dessus. Sachant bien que c'est pas pour ça qu'il y aura traduction.
Et comme l'a indiqué julilou, tu pourras réutiliser tes amorces sur l'ADNc obtenu à partir de tes ADN

[invited1cf8fc4]

Oui c'est vrai mais depuis le début je me borne sur le fait que je veux que mon gène soit présent. Mais en fin de compte grâce à vos réponses je me rend compte que mon espoir est qu'il soit actif (mm si on ne sais pas encore s'il est traduit comme vous m'avez dit).
Le gène a été mis en évidence chez une espèce proche on peut espérer qu'il soit présent chez mon espèce qui est du même genre.
Mon espoir est qu'en fait il existe bien un récepteur à androgène chez mes organismes donc pour cela il faut que le gène soit transcrit et traduit.
Mais c'est vrai que faire d'abord une PCR pour savoir si le gène existe et puis confirmer l'activité du gène sont des informations complémentaires.
Au début du topic je n'avais aucune idée de ce que je devais faire. mes idées n'étant pas claires, mes questions ne l'étaient pas non plus. Et vos réponses m'aide à avancer et à me rendre compte de ce dont j'ai vraiment besoin, et de toutes les erreurs de compréhension que je fais.

Et je pense qu'un bon bouquin de génétique s'impose^^