Chromatographie d'acides aminés

[invite3967e95c]

Bonjour,

Nous sommes 3 lycéen et nous aurions bien besoin d'aide pour nos TPE.
Nous cherchons à mettre en évidence, la présence d'acides aminés dans une algue. Nous allons donc effectuer une chromatographie.

Notre algue (spiruline pour ceux qui connaisse) est une cyano-bactérie.
Nous avons d'un coté les acides aminé pur pour faire les comparaisons et un révélateur mais nous ne savons pas comment faire pour la solution à tester. Les acides aminés sont dans la cellules.

Devons-nous faire exploser les cellules pour les récupérer ? Si oui, comment ? Centrifugation , chauffage, eau distillé ????
Ou bien devons nous seulement dissoudre l'algue dans de l'eau ?
Le test marchera-t-il ?

Si vous pouvez nous aidez merci beaucoup !


Gabriel
-----

[noir_ecaille]

Peut-être Halospirulina ? J'ai un peu cherché, c'est une cyanobactérie. Je ne me souviens plus de la structure de leur paroi (Gram+ ? Gram- ? etc.). De toute évidence, même si cette espèce est halophile, sa paroi bactérienne la protège de l'hypoosmoticité -- donc exit l'éclatement via dilution du milieu par eau distillée.

Je déconseille de faire éclater les cellules par chauffage, ça peut altérer certains acides aminés comme le tryptophane.

Qu'on me corrige si je me trompe, mais on peut peut-être appliquer un protocole opératoire comme ça :
1°) utiliser une solution hyperosmotique contenent du lysosyme pour altérer la paroi bactérienne.
2°) centrifuger, rejeter le surnageant et diluer le reliquat avec une solution hyperosmotique sans lysosyme (étape à répéter au moins trois fois pour éliminer au maximum la présence de lysosyme).
3°) après une dernière centrifugation, diluer à l'eau distillée pour faire éclater les cellules qui ont perdue leur paroi bactérienne.
4°) centrifuger et récupérer le surnageant pour la chromatographie.

J'espère que ça vous aidera

[invite3967e95c]

Merci pour ta réponse très détaillée noir_écaille.

Mais n'existe-t-il pas une solution plus simple ?
J'ai demandé à 4-5 personnes différentes (profs de chimie, physique, bio, forum) et j'ai toujours obtenue une réponse différente.
Je liste les infos que l'on ma données.
-Pas besoins d'éclater
-Eau distillée
-Mixer
-Eau distillée + micro onde + vinaigre blanc
-Broyer + eau distillée
-Eau salé
-Protocole de noir_ecaille (solution hyperosmotique)


Ce serait bête de faire une grosse expérience si il n'y en a pas besoin.
Si quelqu'un a plus de précision ?



Merci d'avance =)

[noir_ecaille]

Pas mal la la solution hypersaline :
1°) cultiver tes algues sur gélose solide, en boîte de pétri par exemple.
2°) mettre un nombre conséquent de colonies en suspension dans une solution H2O, NaCl super-hyper-concentrée (les cellules exsuderont).
3°) (centrifuger puis) analyser le surnageant par chromatographie -- attention à la concentration en NaCl : si ça dissout les protéines et les acides aminés, est-ce que ça ne gêne pas les réactions avec le révélateur choisi ? Dans ce cas une dilution ne serait pas mal.

Quant aux micro-ondes, il s'agit ni plus ni moins que chauffer l'eau même à faible volume, et donc on en revient au problème d'altération de certains acides aminés.

Concernant un broyat, c'est une solution ! Il faut surtout éviter une contamination via aérosols (la partie la plus délicate), après c'est une question d'habitudes, de matériels, de conditions...

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite3967e95c]

Yeah !

J'ai trouvé une solution !!!
J'ai soudoyé un emminent prof de SVT de mon lycée qui m'a donné une solution plus que probable !

Il faut ... digérer les acides aminés !
En effet les acides aminés sont sous forme de protéine il faut donc les découpés avec des enzymes digestive !

Il faut réaliser un hydrodistilat .

Méthode:
Au bain marie 37° mélanger de la spiruline avec de la pepsine (peptidase) faire mijoter une heurs et c'est près !

Voili, voilou !!!

[noir_ecaille]

Oui... A ce ci près que ces mêmes enzymes vont s'entr'hydrolyser, et libérer leur propres acides aminés ! Comment prouver l'absence de certains acides aminés alors ?

De plus, des protéines étant plus ou moins en cours de synthèse tout au long de la vie de ces spyrulles, quel besoin d'hydrolyser les protéines déjà actives, s'il suffit juste des pièces détachées déjà présentes ?

Enfin, pour obtenir un hydrolysat convenable de protéine, il faut d'abord adsorber plusieurs enzymes (chaque enzyme n'est spécifique qu'à un site d'hydrolyse) sur un support inerte, faire passer dessus les protéines (en solution) à hydrolyser, puis faire la chromatographie.

Mais ça demande une extraction très "propre" qui ne risque pas de laisser passer des acides aminés du milieu de culture comme s'ils étaient présents dans nos spyrulles -- et qu'en fait ils en soient absent.

Bah, pour un TPE, ce n'est peut-être pas nécessaire de souscrire un protocole aussi rigoureux...