Q-rt-pcr
Bonjour,
Voilà je dois réaliser mes Q-RT (je n'ai jamais réalisé ce genre de manips!!) pour cela j'ai un gène de ménage MHV et mes échantillons à tester.
Mon souci c'est que je ne sais pas comment faire mes gammes
Si vous pouviez venir à mon secours...
Merci d'avance de vos réponses
Clémence
Si quelqu'un peut faire quelque chose pour moi, ça serait super sympa!!!
Bonjour et bienvenue sur Futura Sciences,
Pour commencer, qu'appelles-tu des gammes? Gammes de dilution, d'étalonnage...
Greg
Oui pardon je ne me suis pas suffisament expliquée.
En fait je viens d'arriver dans mon labo et mon demande de mettre au point cette technique sauf que les personnes qui savent faire sont absents....
Donc en fait j'ai en main:
- ARN à 2µg/µl
- un gène de ménage qui arrive donc juste de chez Eurogentec
- l'appareil de chez BioRad
Donc on m'a dit que pour tester il fallait que je fasse des gammes et que je les compare à la gamme de mon gène de ménage...
Merci de m'avoir répondu
Bonjour,
Plus j'essai de comprendre et plus je m'embrouille!!!!
Donc j'ai mes ARN, il faut donc que je fasse ma RT PCR dessus.... Jusque là ça va...
Donc ensuite, il va falloir que je fasse mes dilutions d'échantillons sur mes produits de RT?
Ma question est surement bête, mais ma concentration en ADNc est la même que ma concentration initiale en ARN?
Honnetement je suis complètement perdue!!!!!
Bonjour clem,
c'est un peu limite de te laisser te débrouiller toute seule en qPCR sans rien t'expliquer. Peut-être que tu devrait commencer par voir ça avec tes encadrants. Parce que pire que rater la manip, tu peux avoir des résultats erronés.
Il y a beaucoup de façons de faire la quantif. Si tu utilises une gamme, elle doit être soit relative (dilution en série de tes cDNA témoins), soit absolue (nombre de copies connu).
Dans mon cas (ce n'est qu'un exemple), j'extraie mes ARNs, je les retrotranscrit, puis je dilue mes cDNA au 1/40.
Parallèlement, je réalise une gamme allant de 1/10 à 1/640 d'un mélange de mes cDNA témoins. Le choix des échantillons importe peu (il y a peu de chances d'être hors-gamme), il faut juste utiliser la même gamme à chaque fois.
Ensuite, quand je prépare ma qPCR, je dépose toujours ma gamme sur la même plaque que mes échantillons à tester. A la fin du run, le logiciel doit te tracer une droite représentant la quantité relative de cDNA cible en fonction du cycle de sortie (Ct). Il va alors utiliser l'équation de cette droite pour attribuer une quantité relative de cDNA à chaque échantillon.
Il faut faire pareil pour ton gène de référence, et normaliser (diviser) la quantité relative de gène d'intérêt par la quantité relative de gène de référence.
J'espère avoir été assez clair.
Mais je ne te conseil pas de te lancer dans la qPCR si tout n'est pas parfaitement clair pour toi. Il y a aussi une démarche qualité très importante (choix des gènes de référence, travail en tripliquet, valeurs critiques d'efficacité et de R² pour la gamme, validation des primers...etc)
Tu peux aussi aller fouiner ici : http://www.gene-quantification.info/
C'est un capharnaüm mais tu pourras y glaner quelques infos.
Bon courage !
Merci beaucoup!!!
En fait la situation est un peu compliquée... Mais j'essaie de glaner des infos un peu partout...
Encore merci
J'ai connu ça : jeté dans la qPCR sans un coup de main en master. Sauf qu'en thèse je me suis rendu compte avec l'expérience que j'avais été un peu léger sur certains points et qu'il fallait tout refaire !!
C'est pour ça que je te conseil de bien y réfléchir avant de lancer ce genre de manips (c'est hors de prix en plus)
