calcul d'activité de différents marqueurs cellulaire

[invite3b64233e]

Bonjour,

J'ai fais un TP de 2 jours en biochimie et maintenant place au compte rendu. Le soucis c'est que je buche énormément sur les calculs, notammenent sur les calculs d'activité.

J'ai 4 marqueurs différents dont je dois calculer leur activité totale et spécifique.

Quelqu'un aurait til des conseils?

Ex : Pour la succinate cytochrome C réductase :
je dois exprimer l'activité totale dans chaque fraction en µmol de DPIP réduit /min et l'activité spé en µmol de DPIP réduit / min/mg de protéines avec un epsilon= 1,26x 10 puissance 5 cm-1.M-1

Une formul magique qui pourrais m'aider?

Merci d'avance
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[invite3b64233e]

Personne n'aurai des indications a me donner?

[invite954f36b6]

Bonjour,

Si on vous donne un epsilon, je suppose que l'activité a été mesurée indirectement par spectrophotométrie?

Si c'est le cas, la loi de Beer-Lambert vous permet de relier l'absorbance mesurée à une quantité de matière (plus exactement une variation de concentration, qui peut être reliée à une quantité de matière produite ou consommée par unité de temps, ce qui exprime votre activité).

La loi n'est vérifiable que si on est en droit d'admettre que la vitesse est linéaire dans vos conditions expérimentales (à voir avec le protocole).

Je n'ai pas suffisamment d'infos pour aller plus loin, si vous bloquez toujours, décrivez plus en détail le protocole et la réaction du dosage.

Bon courage

[invite3b64233e]

bonjour,

merci de votre réponse, en effet la do a été lu toutes les 15 min pendant 2h.

dans la cuve de spectro il a été mi :
940µl de tampon phosphate
10µl de DPIP
10µl d'échantillon à doser
on ajoute 40µl de succinate pour déclencher la réaction
et on lit la do

je vois comment obtenir la concentration
c=(do-0,0052)/(0,0204)
(équation dela courbe=>0,0204x+0,0052)
mais je ne vois pas du tout comment calculer l'activité totale et sprécifique...

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite954f36b6]

Déjà, d'après l'équation de la courbe (fonction affine) on peut considérer que la vitesse est linéaire.
L'équation y=0,0204x+0,0052 (qui je suppose correspond à Do = 0.0204 t + 0.0052 ?) indique une variation d'absorbance par unité de temps (∆do/min).

La loi de BeerLambert donne A = eps x [Concentration] x l
Je suppose que l = 1, on va donc l'enlever dès maintenant.
Cette loi est aussi variable pour des variations d'absorbance et de concentration, ce qui donne

∆A = eps x ∆[C]
Donc votre variation de concentration en DPIP réduit par unité de temps (min si le graphique a été tracé avec x = minutes).

∆[DPIP] = ∆A/epsilon (attention aux unités, particulièrement aux mol de epsilon et aux µmol qu'on vous demande pour l'activité).
Connaissant le volume de l'échantillon dont vous mesurez la DO, vous pouvez en déduite la quantité molaire de DPIP consommée en 1 minute, ce qui correspond à l'activité de votre échantillon.
Pour l'activité spécifique, il suffit alors de diviser cette valeur par la masse d'enzyme introduite dans l'échantillon.

[invite3b64233e]

bon je dois vraiment être une buse....

A correspond bien à l'absorbance?

je ne comprend pas comment je peux en déduire la quantité de mol de DPIP consommé en 1 min à partir du volume de l'échantillon?

Un exemple de calcul pour que je comprenne?

moi j'avais calculer la concentration, multiplier par le facteur de dilution (qui est bien 100 non?)

[invite954f36b6]

Oui, A = Do = Absorbance = densité optique. Désolé, je n'aurais pas dû employer des termes différents, c'est moi la buse.

La loi de Beer Lambert donne une relation entre la DO et la concentration, mais pas directement entre DO et quantité de matière.
Si tu écris ∆A = e x l x ∆C
Avec ∆A en /min, e en /M/cm, l en cm et ∆C en M/min, si tu retournes l'équationen exprimant ∆C = ∆A/el tu trouves ∆C en mol/L/min, or on te demande des µmol/min.

Il faut donc tenir compte du volume d'échantillon.

Un exemple numérique :

Tu fais ta réaction dans un 1 mL (ce qui est ton cas). La droite DO = f(T) donne DO = 2 T (pour simplifier).

Dans ce cas là, on a 0.5 unités de DO produites par unité de temps (une unité de DO pour 2 minutes).

Ddo = Dconcentration x epsilon
Donc D concentration = 0.5 / (1,26x 10^5)
= 4x10^-6 mol/L/minute

Soit 4 µmol/L/minute.

Tu utilises une fraction de 1 mL, donc l'activité dans ta fraction est égale à 4 x 10^(-3) L = 4 x 10^(-3) µmol/min.

C'est un peu plus clair?


edit : D'après ce que je comprends on te demande l'activité dans la fraction de 1 mL, pas dans les 10 µL de l'échantillon, si j'ai mal compris il faut bien sûr tenir compte de la dilution de l'échantillon. Si je ne me suis pas trompé sur l'interprétation, c'est l'activité spécifique qui va tenir compte de la dilution (en ramenant l'activité à la quantité d'enzyme, et donc au volume de l'échantillon ajouté à ta fraction de 1 mL).

[invite3b64233e]

je me suis permise de vous écrire par message privé.