Marquage de l'activité peroxydase

[Guillaume69]

Bonjour,

Savez-vous s'il existe un marqueur de l'activité peroxydase d'une cellule, qui pourrait être utilisé en FACS ?

Je ne trouve que des tests biochimiques, ou d'immunohisto, et ça ne m'aide pas vraiment...

Merci de votre aide
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[invite75e918c6]

Pourquoi ne pas essayer de perméabilisé la cellule pour vos anticorps (couplé à un fluorochrome) qui se fixeraient sur les péroxydases? Je ne sais pas si expérimentalement c'est faisable.

[Guillaume69]

Hello

Ce qui m'intéresse plutôt, ce n'est pas la présence de la peroxidase, mais bien son activité.

Si je ne trouve rien d'autre, je peux toujours essayer... Mais est-ce qu'il n'y a pas un risque, si je perméabilise mes cellules ?

1. Qu'elles crèvent, tout simplement, ce qui n'est pas souhaitable évidemment ?

2. Que je plante la fixation / l'emission d'un signal correct pour tous mes autres anticorps (j'utilise un mix de 4 ou 5 anticorps, tous membranaires).

[invite75e918c6]

en faite, c'est le FACS qui me dérange... si j'étai dans votre cas, j'aurais tenter de purifier la protéine puis je regarderai sa cinétique par spectrophotométrie avec un substrat chromophore. Mais ensuite appliquer cette méthode sur une FACS.....?

[A voir en vidéo sur Futura]

[Flyingbike]

Visiblement c'est possible, il faut utiliser des substrats dont le produit est mesurable, (autre que DAB ou assimilé) comme ici : http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=19661826

[Guillaume69]

en faite, c'est le FACS qui me dérange... si j'étai dans votre cas, j'aurais tenter de purifier la protéine puis je regarderai sa cinétique par spectrophotométrie avec un substrat chromophore. Mais ensuite appliquer cette méthode sur une FACS.....?

Quelle protéine ? ^_^

Mon problème, c'est de pouvoir discriminer deux sous populations de cellules dont on ne connait pas de marqueurs spécifiques.
Par contre, on sait depuis longtemps que l'une a une activité peroxydase, l'autre pas.

Donc s'il existe une méthode fiable pour marquer des cellules dont la peroxydase est active, peut-être que je peux arriver à faire le tri entre mes deux populations ?

Donc je me demandais s'il y avait des assays fiables de ce type là...

Visiblement c'est possible, il faut utiliser des substrats dont le produit est mesurable, (autre que DAB ou assimilé) comme ici : http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=19661826

Je vais essayer de chercher de ce côté là... De ce que j'ai vu, tout a l'air optimisé pour des suivis fluorimétriques in vitro ; j'ai rien vu concernant une utilisation en FACS.
Je suis donc très sceptique ^_^

[Flyingbike]

ah oui il n'existe pas un protocole pour tout. Si ca fait de la fluo in vitro, je ne vois pas pourquoi ca ne serait pas adaptable au facs. Il y a sans doute de la mise au point a faire mais ça ne me parait pas du tout irréalisable.

Bon courage

[LXR]

Pour info, j'en connais qui font du bleu trypan en FACS et c'est fiable. Certainement ce colorant fluoresce pour que ce soit réalisable, mais c'est un bon exemple d'adaptation d'une technique au FACS, comme le suggère Flyingbike pour le marquage peroxydase. Il ne reste plus qu'à savoir à quelle longueur d'onde te placer et le tester. Il te faudra tout de même confronter les résultats obtenus avec cette nouvelle méthode avec la même manip utilisant une technique plus "standard" de mesure de l'activité peroxydase. Je pense qu'établir une telle comparaison est crucial pour la mise en place d'une nouvelle approche méthodologique. Et après pourquoi ne pas essayer de la publier dans un journal de méthodes?