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problème de qPCR sur des échantillons de maïs



  1. #1
    alinevert

    problème de qPCR sur des échantillons de maïs

    Bonjour,
    je cherche à mettre au point une méthode de quantification en Evagreen d'un champignon dans des échantillons de maïs cultivés en serre, et tout a bien marché (dessin d'amorces spécifiques, quantification d'ADN du champignon pur...) mais dès que j'ai voulu passer les échantillons de maïs, j'ai obtenu des résultats non répétables, avec des pics de fluorescence qui ne correspondent pas au champignon et surtout qui changent d'un jour à l'autre. Etant donné que lorsque l'on mélange de l'ADN du champignon pur et de l'ADN de maïs pur on n'a aucun problème, j'ai pensé qu'il y avait des composés dans mes échantillons qui inhibaient la qPCR, mais j'ai testé plein de méthodes d'extraction et de purification et rien n'y fait... Il faut savoir que lorsque je passe mes échantillons en PCR, j'obtiens bien une bande correspondant au champignon, mais également une bande de au niveau du marqueur de 75 paires de bases... cette bande est toujours plus forte quand le champignon est présent.
    Si quelqu'un a des idées, je suis intéressée!
    Merci d'avance de vos réponses

    -----


  2. #2
    TanguyE

    Re : problème de qPCR sur des échantillons de maïs

    Bonjour,

    As tu pensé à blaster tes oligos?

  3. #3
    Vagalume

    Re : problème de qPCR sur des échantillons de maïs

    Question idiote, mais tes primers ne peuvent-il pas s'hybrider partiellement sur de l'ARN de ce gène ?

  4. #4
    alinevert

    Re : problème de qPCR sur des échantillons de maïs

    Bonjour,
    oui j'ai blasté mes oligos et j'ai fait une PCR sur de nombreuses de champignons que l'on rencontre sur le maïs, a priori elles sont spécifiques. Après je n'ai pas eu accès à de l'ADN de maïs pur (trop d'endophytes naturellement présents dans les semences) donc je ne peux pas certifier à 100% que les amorces ne s'hybrident pas avec le maïs, mais étant donné que certains échantillons (contenant 100 ng de maïs) ne réagissent pas, je ne pense pas qu'elles amplifient le maïs...
    En ce qui concerne l'ARN, je mets de la RNase dans l'AP1 et j'incube pendant une heure, donc a priori l'ARN est détruit.
    Merci pour vos réponses

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