Problemes de PCR

[invite655bc31e]

Alors apres avoir parcouru tous les topics du forum sur ce sujet je n'ai toujours pas trouvé de solution à mon probleme alors je poste à mon tour.

Je suis stagiaire dans un labo de recherche, où je realise des PCR dans le but de détecter de l'ADN proviral integré dans de l'ADN génomique extrait à partir d'organes de souris.

Mon probleme : apres avoir reussi cette manip de PCR à plusieurs reprises, voilà un mois que je n'ai plus aucun resultat. Sur l'electrophorese, je ne detecte aue mes marqueurs de taille, il n'y a aucun produit PCR, et meme mon controle positif (primers pour l'actine) sort negatif.

Le probleme ne vient pas de l'extraction de l'ADN puisque je verifie la qualité de celui-ci sur gel d'electrophorese et les concentrations obtenues sont correctes.
Entre les PCR aui ont fonctionné et celles qui n'ont rien donné rien n'a changé : memes conditions de préparation du mix, meme programme sur le thermocycleur, meme qauntité d'ADN utilsée...

Nous avons essayé de :
-changer de Taq (2 fournisseurs differents, et avec elle le tampon PCR)
-changer de solution de dNTP
-changer les primers
Malgré cela je reste sans résultat..

Bref, si quelqu'un a une idée, une solution a proposé ce serait super ! Merci d'avance
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[invite4ff72fd5]

Salut,

a lire ce que tu ecris on peut rien dire... tu semble dire que vous avez tout verifie donc on peut pas comme ca deviner.
Tu es sur que personne n'a modifie le programme que tu utilises?
combien de fois as tu re essaye en faisant bien attention a tout ajouter dans ton mix? souvent quand ca marche pas c'est une etourderie.

Bref... reverifie la sequence de tes primers, reverifie le programme que tu utilises, fais bien attention a ton mix et ca devrais marcher il y a pas de magie dans la PCR.

PS : desole pour le manque d'accent je suis sur clavier anglais.

[invite655bc31e]

Merci de ta reponse.

Je sais que je donne l'impression qu'on a tout verifié, mais c'est justement parce qu'on a cherché par tous les moyens une solution et que je suis a court d'idées que je poste ce topic.

J'ai bien revérifié le programme, il n'a pas été modifié. J'ai également revérifié la préparation de mon mix, et j'ai demandé confirmation pour etre sure de ne pas avoir fait une erreur, il semble qu'il soit préparé correctement. J'ai aussi pensé a l'étourderie, parce que j'en fais comme tout le monde, mais la c'est au moins la dixieme PCR de suite qui ne fonctionne pas, alors a moins d'etre distraite a chaque fois et de refaire a chaque fois la meme erreur ca me semble un peu gros...
Une de mes hypotheses est que ca vient des primers vu qu'un de mes collegues fait de la RT-PCR qui ne marche pas non plus et que c'est quasi la seule chose qu'on utilise en commun, mais ils ont été conservés correctement et avaient donné des résultats positifs auparavant, donc je ne vois pas pourquoi du jour au lendemain plus aucun de mes 7 couples ne fonctionne...

Enfin bref, un vrai casse-tete j'en conviens...

PS : pas grave pour les accents, j'ai aussi unn clavier anglais qui m'en fait baver !

[invite4ff72fd5]

Recommandez toutes vos amorces et voyez...
Votre PCR est elle super sensible aux ecarts de temperatures?
Votre thermocycleur a peut etre besoin d'etre re-calibre ?

sinon je sais pas quoi dire ;]

Et le sacrifice le jour de pleine lune ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite655bc31e]

Non a priori pas tres sensible aux ecarts de temperature, et cette aprem j'ai lancé en parallele la meme PCR dans le thermocycleur habituel et dans un autre thermocycleur et ca ne change rien, donc ca ne semble pas venir de ca...

Notre ultime tentative dont j'attends les résultats a été de changer encore de dNTP, bien que ceux que j'utilise soient neufs, car apparemment il est déja arrivé qu'ils rencontrent des problemes avec un mix neuf de dNTP... Donc on verra. Apres effectivement il faudra peut-etre au'on renouvelle une commande de nos amorces.

Sinon oui c'est une bonne suggestion, je vais penser serieusement au sacrifice le jour de pleine lune...!