probleme de transfection

[invite90f5edc9]

Bonjour a tous,

Voila j’ai fait une erreur et de manip et je voudrais votre aide pour évaluer les dégâts:

Normalement je devais cotransfecter dans une lignée cellulaire un plasmide avec le promoteur qu’on étudie et qui contrôle l’Expression de la luciferase, et le plasmide controle codant pour la beta-Gal.

Problème : une fois la transfection finit (seulement 5-10 minutes aprés), je m’aperçois que la personne qui a écrit les concentrations de plasmides a fait une erreur. Donc mon plasmide control est 10 fois moins concentré…du coup dans la panique (il me faut absolument réussir cette transfection) j’ai procédé a une autre transfection sur les mêmes cellules avec le plasmide contrôle pour essayer de complémenter (dans les 30 minutes après la première transfection)…je sais c’est stupide. Mais quand on panique…

A votre avis est-il possible que le résultat final ressemble a quelque chose ou est-ce sur que c’est à jeter?

Bien sur la manip sera à répéter correctement plus tard….
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[invitee4e79868]

Bonjour,

Donc, en gros, les cellules ont été percées de petits trous, de l'ADN inconnu aggloméré est rentré à l'intérieur, puis elles ont commencées à se réparer... Et à ce moment là, il y a de nouveaux des trous, de nouveaux de l'ADN (plus nombreux), et il faut de nouveau réparer. Tu vas probablement avoir une haute mortalité cellulaire (plus que d'habitude en tout cas), donc un max de déchets cellulaire dans le milieu. Mais les survivantes devront être normal (ou stressé à la limite, ce qui est jamais bon dans des expériences d'expression de gène).
Pour ma part, je prendrai en considération le coups de l'analyse. Si tu analyses les cellules après coups avec un qPCR par exemple (ce qui ne coute pas très cher et est rapide) => continues. Par contre, si ce sont des techniques plus complexes (IF, FISH, FACS où il y a besoin de réactifs cher comme les Ac), cela ne vaut pas beaucoup le coups.
Pour ma part, ce genre d'accident rétrograde une manip classique (censé fournir des résultats solides) en une manip préliminaire, qui donne une tendance à la manip, mais qui ne peut pas être incorporé dans des résultats statistiques (sauf si tu fais toujours la même erreur ).

[invite90f5edc9]

Merci pour ta réponse rapide. En fait mon chercheur me fout une pression pas possible, donc a l'idée que cette manip échoue je stressais un maximum.
En fait c'est sur que d'un point de vue scientifique cette manip n'est pas vraiment utilisable...et demandera a être refaite. Sinon j'ai eu mes résultats (fait en essai luciférase) et ca reproduit les tendances des autres manips...