échec de révélation sur gel d'agarose des produits d'ADN après purification

[invitebe5a8478]

Bonjour,

j'ai purifié les ampliquants d'ADN manuel par le kit QIAquick, après je suis passée au électrophorèse afin de vérifier la présence de l'ADN.
Premier souci , c'est la présence de l'odeur de l'éthanol, à noter que ce dernier est présent dans le deuxième réactif (sert pour lavage) de kit est ce que c'est normal ?!
deuxième souci, quand j'ai essai de spoter l'ADN dans le puits de gel , il se diffuse directement en dehors de puits dans le liquide de mogration (TBE), après j'ai changé le tampon de charge, et c'était marché avec quelque échantillons!

est ce que ce là veux dire que il y' a pas d'ADN!? ou bien c'est l'éthanol qui a empêché le tampon de charge à précipité l'ADN?!

Merci beaucoup
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[Flyingbike]

bonjour

normalement, avant d'éluer (EB ou H2O) la colonne est centrifugée pour faire passer le tampon de lavage puis recentrifugée a vide. Normalement plus un poil d'ethanol....

[invitebe5a8478]

effectivement, j' ai fait la 2ème centrifugation !
et pour le deuxième problème comment vous l'expliquez ? s.v.p

merci

[invitea4b00eb7]

Bonjour,

Le tampon de charge ne permet pas de précipiter l'ADN mais de le faire couler dans les puits. Êtes vous sure que vôtre système de migration ne présente pas un problème au niveau de la tension par exemple ou alors une électrode qui ne marcherait pas (est ce que ça fait des bulles)?

Normalement on lave avec un tampon qui doit contenir de l'éthanol mais l'ADN reste encore sur la silice de la colonne. On centrifuge pour éliminer l'éthanol et on recentrifuge la silice à vide pour finir de sécher (l'éthanol peut sinon faire des interférences lors du traitement de l'ADN pour le dosage ou la migration) On dépose ensuite de l'eau stérile ou alors un tampon d'élution sur la silice de la colonne(perso je préfère l'eau). Pour augmenter l’efficacité, on peut laisser 5min l'eau sur la colonne avant de centrifuger. On peut aussi faire l'élution en deux temps, on divise la proportion d'eau à ajouter, on élue une fois et on dépose le restant d'eau pour finir de rincer (que l'on ajoute ensuite au premier éluât). On peut ensuite jeter la colonne et congeler l’éluât qui contient l'ADN.

Bon courage

[A voir en vidéo sur Futura]