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Amorce RT-qPCR exon exon




  1. #1
    val62

    Amorce RT-qPCR exon exon

    Bonjour,

    Je fais des RT-PCR en 2 étapes, et je dois designer mes amorces.
    Je suis complètement perdu par rapport design, on me dit que pour éviter d'amplifier de l'ADNg je dois utiliser des amorces exon-exon et qu'il y a différente stratégie de design
    1-Le milieu d'une des amorces chevauche une jonction exon-exon
    2- L'extrémité 5' ou 3' d'une des amorces chevauche une jonction exon-exon
    3- L'amplicon chevauche une jonction exon-exon (les amorces sont dessinées sur 2 exons différents)
    4- Le chevauchement des amorces sur une jonction exon-exon n'est pas possible (par ex. le gène n'a qu'un seul exon)

    Avez vous des explications, des schemas pour m’éclairer sur ce sujet?
    J'ai bien compris que l'exon est la séquence codante, l'intron est la séquence non codante et qu'après epissage il n'y à plus d'intron et qu'on obtient notre ARNm mature.

    Merci de votre aide

    -----


  2. #2
    Matdu17

    Re : Amorce RT-qPCR exon exon

    Quand tu fais une RT-PCR, tu ne veux amplifier que des séquences de cDNA. Pour éviter d'amplifier avec les mêmes primers la séquence génomique de ton gène en même temps que le cDNA (parce que tu risques toujours d'avoir un peu d'ADN génomique dans ta préparation d'ARN puis de cDNA), il faut que tu t'assures que ta PCR ne le permet pas.

    Soit:
    1-2: avec une ou des amorces qui chevauchent une liaison exon-exon, car cette séquence n'existe pas en tant que telle dans le génome, donc pas de risque d'amplifier du génomique.
    3: que tes deux amorces soient sur des exons différents, avec un ou plusieurs introns de bonne taille entre les deux, ce qui fait que le temps d'élongation dans ton cycle de PCR ne permettra pas d'amplifier la séquence génomique, trop longue.
    4: si tu n'as qu'un seul exon tu n'as pas le choix: tu fais des primers dans cet exon et tu espères avoir bien éliminé l'ADN génomique (traitement a la DNAse pendant la purification des ARNm). Tu peux en plus faire un couple de primers qui te donnera un produit de même taille mais avec l'un des primers hors du gène, qui te servira de contrôle négatif.

    Primer_Design_for_the_qPCR_step_of_RT-qPCR-lg.jpg

    Voilà de quoi designer tout ça, tu peux régler à peu près tous les paramètres dont du parles.
    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

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