Informations gènes menagers HPRT pour QPCR

[florinebluecherry]

Bonjour,

j'ai réalisé des extractions de foie sur des souris pour faire une RT QPCR et ensuite une QPCR nous utilisons comme gènes de référence (gènes mènages) HPRT : protéine
cytoplasmique intervenant dans la synthèse des purines (Gènes moyennement exprimés dans le modèle murin: estimés entre100- 1000 molécules par cellule ). Ma question est-ce normal que mon gène de réf (HPRT) sort en Ct à 28. Après j'ai voulu tester une HPRT venant d'une autre équipe de recherche est là elle sort entre 25 et 26. Mais chose étrange c'est que quand on compare avec les gènes qui nous intéresse (notamment ripk3 dont je veux savoir les résultats) celle qui sort à 28 montre des résultats interessant et par contre celle entre 25 à 26 les résultats sont moins intéressante.. je ne comprends pas quelqu'un pourrait m'expliquer ou me conseiller ?

d'avance merci
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[Flyingbike]

un ct brut n'a pas trop de sens

Quel est votre rendement en ARN ? quelle quantité dans la RT ? quelle dilution pour la qPCR ?


Si vos résultats diffèrent selon que vous normalisez avec une paire HPRT ou une autre, c'est un problème.

Donnez quelques illustrations, par exemple vos courbes, ou les Ct dans différents groupes, etc.

[florinebluecherry]

Alors mon rendement en adn était en moyenne entre 3000 et 5000 ng/ul (25 échantillons). j'ai réalisé plusieurs dilution : une pour arriver à 1000 ng/ul de concentration et ensuite une pour arriver à 100 ng/ul et la derniere avec le mix 8 ul de mix et 2 ul dadn) pour arriver à 20 ng/puits.

[florinebluecherry]

La photo que j'ai envoyé c'est HPRT qui donne en moyenne 25 26 de Ct et donc lautre on est plus au alentour de 27 28...

[A voir en vidéo sur Futura]

[Flyingbike]

20ng/puits dans votre qPCR me parait énorme. Vous utilsez quel kit de RT et de qPCR ?
Je n'ai pas compris quelle quantité totale d'ARN vous aviez par réaction de RT. 1000ng ? 2000 ?

Dans votre tableau vous avez deja une différence entre vos groupes.

Avez vous vérifié les 2 paires d'amorces par BLAST ? est ce que le Tm du produit de qPCR est correct ?