Amorce spécifique PCR détection OGM

[Noobdeservice]

Bijour,

Je suis un nouveau ( j'ai fait ma présentation sur le forum aujourd'hui ) et je ne suis pas du tout du domaine scientifique, pour autant mes questions ne relève que du monde scientifique.

Mon cas de figure qui amène à poser les questions aujourd'hui :

Je m'intéresse de près à la PCR ( surtout depuis que l'on ma montré la " mini PCR " https://www.minipcr.com/product/mini...covery-system/ ) dans le but de pouvoir comprendre et faire de la détection d'OGM car l'un de mes camarades vivant dans le sud de la France vois depuis 1 an des Espagnols cultivé du maïs MON 810 à proximité quasi-immédiate de ces terres et il se trouve qu'il fait aussi cette culture.

Alors il existe effectivement des bandelettes que l'on peut acheter ou sinon il faut envoyer des échantillons à un laboratoire qui fait justement une PCR et c'est là que c'est problématique puisque le nombre d'échantillons peut être important et que son coût d'analyse l'est tout autant.

D'ou l'intérêt de pouvoir faire soi même une PCR de bonne qualité et si témoin positif demander confirmation à un laboratoire spécialisé.



Allons y pour les questions qui me posent problème :

1 - Sur le MON 810 le promoteur du gène est le CAMV P 35S avec pour gène terminateur T-nos, l'Europe en matière de détection d'OGM à rendu la fiche suivante ( http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/gmom...ELE-00-012.pdf ) qui indique

Primer forward

CaMV P-35S : 5’-GCCTCTGCCGACAGTGGT-3

T-nos : 5’-CATGTAATGCATGACGTTATTTATG-3’


Primer Reverse

CaMV P-35S : 5’-AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC-3’

T-nos : : 5’-TTGTTTTCTATCGCGTATTAAATGT-3’

Est ce que c'est séquences spécifique peuvent être utilisé de manière universelle pour détecter le CAMV et T-nos dans tout tissu végétaux ? Dans la mesure ou c'est 2 éléments sont utilisé de manière importante dans les constructions OGM c'est tout à fait intéressant.


2- Est ce la même procédure non pas pour détecter le promoteur et le terminateur mais directement le gène d'intérêt ? ( Je me doute qu'il faudra des séquences spécifiques pour le gène en question ) ?

3- Est ce que le fait d'utiliser des séquences spécifique qui sont faîtes pour de la RT-PCR ( c'est le cas de la détection OGM européenne ) " pose " problème si on utilise une PCR classique pour la détection ?

4- La synthèse des amorces peut se faire auprès de n'importe quelle labo de biologie cellulaire ? Comme Thermofisher ou autres .

5- Que pensez-vous des kits d'extractions d'ADN ( pour des noobs ) pour tissu végétaux ? Des adresses d'entreprise et de kit à conseiller ( Même si ce sont des entreprises étrangère ce n'est pas grave ) ?


Merci de m'avoir lu et merci d'avance pour les réponses.
-----

[minushabens]

hum! je me demande ce qui te fait penser que tu pourras faire tout ça pour moins cher qu'un laboratoire spécialisé, tout en étant aussi fiable. A ta place je chercherais du côté des associations de cultivateurs bio, s'il n'y aurait pas, soit des compétences en génétique soit moyen de mutualiser les coûts.

[Noobdeservice]

Bonjour,

hum! je me demande ce qui te fait penser que tu pourras faire tout ça pour moins cher qu'un laboratoire spécialisé

- Prix analyse par échantillon PCR laboratoire minimum 85 Euros, maximum 120 Euros et délai d'attente 4-5 jours, possibilité 48h00 en option ( prix de l'option 30 Euros en moyenne ).

- Prix analyse par échantillon Mini PCR 5 Euros, résultat en 35 min ( extraction adn inclus ), possibilité de réaliser le test directement sur le terrain. Et un prix de 2500 Euros pour tout l'équipement ( toutes options d'on la centrifugeuse ) + le coût des consommables qui en en mode full kit ne revient pas à cher. Même si dans un premier temps je vais en consommer pas mal pour apprendre.

J'ai sollicité les fabricants du Mini PCR sur que je cherchais à faire et outre la confirmation par mail, ils ont indiqué sur leur site les éléments qui permettent de le vérifier :

- " A simple, economical protocol for DNA extraction and amplification where there is no lab " => https://www.minipcr.com/wp-content/u...COGR-final.pdf

- " Sur le terrain " = > https://www.minipcr.com/applications/in-the-field/

- " Sur la performance " => https://www.minipcr.com/wp-content/u...validation.pdf


Je pense le plus important le fait d'avoir une indépendance ( et d'apprendre ) pour faire ce genre de test ( difficile de donner un prix à ça ). Cette vidéo est particulièrement intéressante " miniPCR - Science for everyone, everywhere " ( )

Il parle justement à 1 min 51 de pouvoir détecter les OGM.

[minushabens]

J'ai bien peur que ça ne soit une arnaque.

Je bosse dans un labo où on fait quotidiennement ce travail d'identification d'organismes dans des prélèvements issus de l'environnement. On est tout le temps confronté à des problèmes, soit de mise au point de PCR (ça ne va pas de soi), soit de contamination (entre autres). On a des ingénieurs qui travaillent sur ces questions et je peux te dire que même après 10 ans d'expérience ils ont parfois du mal à trouver ce qui ne va pas. Si tu ne connais rien à la biologie moléculaire tu vas vraiment galérer.

De plus la PCR en elle-même ne détecte rien: elle amplifie. Une fois que tu as amplifié de l'ADN il te faut faire une électrophorèse. C'est encore une autre technique, qui demande un matériel et des compétences spécifiques. Je pense que c'est illusoire de penser arriver à faire du bon travail avec peu de moyens et de compétences.

[A voir en vidéo sur Futura]

[Noobdeservice]

J'ai bien peur que ça ne soit une arnaque.

Il serait extrêmement curieux qu'une arnaque soit repris et vendu par Sordalab en France ( https://www.sordalab.com/FR/catalogu...MINIPCR16,.php ) en prime Sordalab ajoute :

- " Cet appareil d'une grande fiabilité a été envoyé dans l’espace dans le cadre de la compétition Genes in Space student "

- " Pensé, conçu et construit aux États-Unis, conception robuste et miniaturisée. Fonctionne avec n’importe quel consommable. Validé par de nombreux scientifiques et publié dans des revues scientifiques renommées, telles que Nature Methods, il a été envoyé dans l'espace par la NASA.

- Nature Methods : Volume 12 , numéro 5, Mai 2015 ( https://www.sordalab.com/RESSOURCES/...DS_MINIPCR.pdf )


------------------------

De plus la PCR en elle-même ne détecte rien: elle amplifie. Une fois que tu as amplifié de l'ADN il te faut faire une électrophorèse. C'est encore une autre technique, qui demande un matériel et des compétences spécifiques.

C'est là ou je me rend compte que vous n'avez pas pris la peine de consulter le premier lien que j'ai donné sur " Mini PCR "

Je m'intéresse de près à la PCR ( surtout depuis que l'on ma montré la " mini PCR " https://www.minipcr.com/product/mini...covery-system/ )

Ce lien ne montrait pas que la machine à PCR mais un kit qui comprenait la PCR et aussi le système " blueGel™ Electrophoresis System with Integrated Illuminator ".

La vidéo en Français de Sordalab sur l'utilisation complète du pack

[minushabens]

quand je parle d'arnaque, je ne veux pas dire que leur machine de fonctionne pas. Je veux dire que la vendre au grand public en lui faisant croire que c'est facile à utiliser dans sa cuisine et que ça donne des résultats fiables est un peu malhonnête. Si j'étais toi je chercherais une autre solution. Mais tu utilises ton argent comme tu veux. Tu pourras commander des kits d'extraction d'ADN et des amorces, peut-être pas en France parce que les boîtes qui font ça ici ont plutôt tendance à travailler avec des clients institutionnels mais aux Etats-Unis certainement.

[Noobdeservice]

c'est facile à utiliser dans sa cuisine et que ça donne des résultats fiables est un peu malhonnête.

Je vais demander à Sordalab si les résultats sont fiables mais je pense bien que oui.

Sinon que pense tu de la comparaison qu'à fait le Mini PCR vs Biorad S1000 ( que tu peux retrouver ici : https://www.minipcr.com/wp-content/u...validation.pdf )

Et la nouvelle étude du 28 juin 2019 ( https://www.biorxiv.org/content/10.1101/650614v2 ) dans lequel on trouve :

" With the recent advent of portable and affordable genetic technologies, it is now possible to tackle logistical considerations. Mobile genetics labs, with the capacity for in situ DNA extraction, amplification and sequencing, can produce scientifically reproducible data under field conditions, minimizing the time between sample collection and data analysis. Additionally, mobile labs offer powerful training opportunities for in-country scientists that enable local students and researchers to actively participate and contribute fully to the research enterprise, and that further empower these communities to contribute to the conservation dialog.

Here, we show “proof of concept” by deploying a miniaturized thermal cycler alongside the Oxford Nanopore MinION DNA sequencer in Madagascar

--------------------------------------

Les kits d'extractions d'ADN sont proposé par plusieurs sociétés reste à trouver une qui à des qualités supérieur par rapport aux autres, d'ailleurs c'était l'une de mes questions dans mon post initial

5- Que pensez-vous des kits d'extractions d'ADN ( pour des noobs ) pour tissu végétaux ? Des adresses d'entreprise et de kit à conseiller ( Même si ce sont des entreprises étrangère ce n'est pas grave ) ?

Pour les amorces, j'ai trouvé je le ferais avec ThermoFischer ( ils ont l'air assez chère mais bon faut bien essayer ) : https://www.thermofisher.com/fr/fr/h...cleotides.html


Et sinon tu n'a pas d'idée sur les questions que j'ai posé dans mon post initial ? ( A part la question 4 car j'ai eu la réponse ! ) Tu te poses ici en professionnel du domaine, mais à aucun moment tu n'apportes de réponse ou début de réponse aux questions posé c'est qui est curieux !

[minushabens]

Je ne suis pas spécialiste de "bio-mole" comme on dit. Je travaille dans un labo où c'est le pain quotidien mais moi je fais autre chose (j'analyse les données issues de séquençage par exemple). Donc je ne peux pas donner de réponses précises à tes questions.

Je pense que tu vas perdre de l'argent avec ce matériel que tu ne sauras pas faire fonctionner et c'est juste pour cela que je suis intervenu ici. Pour te donner une idée des difficultés qui t'attendent, on a dans mon labo un nouveau projet qui consiste à chercher de l'ADN de certains organismes dans l'environnement (dans des échantillons de sol). Or ça fait six mois que les ingénieurs essaient d'amplifier l'ADN de ces échantillons et pour l'instant ils n'arrivent à rien: les témoins négatifs, les échantillons et les témoins positifs donnent à peu près les mêmes choses (ce qui est aberrant). Il y a un truc qui empêche la PCR de fonctionner et ils ne savent pas quoi. Ils trouveront, je n'en doute pas mais pour toi qui n'es pas du métier ça risque d'être plus difficile.

[Flyingbike]

1- si le transgene est le même, oui
2- oui avec les bonnes amorces
3- non, pas de problème, en théorie du moins. L’optimisation de la réaction risque d’être différente (et on perd le côté quantitatif)
4- n’importe quel labo non, tous ne font pas de synthese d’adn
5- pas d’avis. Le kit de référence est probablement celui de qiagen, mais le prix est élevé


Pour le reste je rejoins minushabens et je donne le même avis qu’a tous les biologistes de garage. Nous, professionnels, avons le matériel de pointe et des réactifs haut de gamme. Une formation et une expérience de plusieurs années. Et ça peut être compliqué malgré tout.
Alors faire ça en «*35 minutes*» sur place sans expérience ..... j’ai du mal.... et à moins que vous ne fassiez ça en routine, en comptant la mise au point ça ne sera pas forcément rentable

[Noobdeservice]

Bonjour, Merci d'avoir répondu

1- si le transgene est le même, oui

C'est parfait merci.

2- oui avec les bonnes amorces

C'est parfait merci.

3- non, pas de problème, en théorie du moins. L’optimisation de la réaction risque d’être différente (et on perd le côté quantitatif)

Intéressant je vais donc chercher une paire d'amorce spécifique qui ne relève pas de la RT-PCR et pour le côté quantitatif ce n'est pas grave car je veux juste savoir si le transgène est présent et non pas combien de copies il y'a.

4- n’importe quel labo non, tous ne font pas de synthese d’adn

J'ai trouvé merci. Thermofisher le fait et comme je dispose d'une adresse Pro ça ne pose pas de problème pour les livraisons.

5- pas d’avis. Le kit de référence est probablement celui de qiagen, mais le prix est élevé

Celui que j'ai trouvé ( https://www.lanexxo.fr/nexxo-prep-plant-dna-mini.html ) mais tout ce que j'ai pu lire sur livre ou forum conseille de se faire la main sur ce type de kit et de passer ensuite à autre chose genre ça ( https://www6.inra.fr/cahier_des_tech...enedit_ADN.pdf )

Nous, professionnels, avons le matériel de pointe et des réactifs haut de gamme. Une formation et une expérience de plusieurs années.

Je le conçois parfaitement cependant je rappelle que je cherche des choses qui sont clairement identifié ( je ne fait pas de la R&D fondamentale ) dans le cas présent dans le cas de la détection OGM et grâce aux données fournis par l'EFSA et à la réglementation, on connait le : promoteur- gêne d'intérêt - terminateur ( dans quels plantes il est, ou il est cultivé et on connait les séquences d'identification ) si nécessaire on peut regarder plus en détails dans les études ou tout simplement dans le brevet.

Alors faire ça en «*35 minutes*» sur place sans expérience ..... j’ai du mal.... et à moins que vous ne fassiez ça en routine, en comptant la mise au point ça ne sera pas forcément rentable

Euh en fait ça serait plutôt 01h35 car la moyenne des kits extractions d'ADN prend 01h00 et quand à l'expérience il en faut quand même pour ne serait ce que savoir :

- Manipuler le/ les micro-pipettes
- Apprendre à remplir les puits correctement sans en foutre partout
- Travailler en condition stérile et comparer les résultats dans une situation de terrain donc non stérile.

Dans un premier temps je vais faire des test sur des gènes " simple " trouvable dans n'importe quelles plantes pour se faire la main quand à la section OGM, ( une fois plus d'expérience ) je pense demander au service technique Thermofisher de me faire une synthèse de gène et une construction correspondant à ce que je cherche sans mettre cela dans un vecteur.

Quand à la rentabilité dans mon cas c'est secondaire, cela n'a d'importance que pour mon collègue du fait de la proximité du mais OGM MON 810

----------------

Au passage vous savez si il est possible de demander dans le cas de Thermofisher ou autres une synthèse de gène qui ne comprendrait que le promoteur ou le terminateur et de mettre cela dans un plasmide ?

[Flyingbike]

Oui, ça se fait couramment
C’est par contre bien plus cher que la synthèse d’oligonucleotides.
Pour un gène de quelques kb, c’est de l’ordre du millier d’euros