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HPLC - temps de rétention



  1. #1
    hplc-valesp

    HPLC - temps de rétention


    ------

    Bonjour à tous,
    je suis en train d'analyser un mélange protéique/peptidique par RP-HPLC, colonne C18.
    Pour cela j'utilise deux phases : une phase aqueuse contenant du TFA et une phase organique (acétonitrile/H2O/TFA) avec un gradient linéaire puis une phase de rincage entre chaque injection.

    Mon problème : en injectant plusieurs fois le même échantillon, les pics obtenus sont bien identiques mais apparaissent à des temps de rétention différents (quelques minutes en plus ou en moins!!)

    quelqu'un aurait-il une idée qui pourrait expliquer ça svp?

    Merci d'avance.

    -----

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  3. #2
    HarleyApril
    Modérateur

    Re : HPLC - temps de rétention

    Bonsoir

    Si tu es sûr que ton cycle est toujours le même (y inclus l'injection) tu peux te poser des questions sur la durée de ré-équilibration de la colonne ou la température.
    Cordialement

  4. #3
    sfnsfn2

    Re : HPLC - temps de rétention

    comme avait dit HarleyApril
    l'equilibre de colonne puisqu'il y a du TFA dans la phase mobile
    mais pourquoi tu ajoutes une phase de rinçage
    qui se ressemble s'assemble (Homère)

  5. #4
    rododu27

    Re : HPLC - temps de rétention

    Bonjour,

    Juste une petite question, pourquoi ne pas faire de la chromato ionique type silice greffé avec des groupements carbonates et faire un gradient de pH. La séparation se fera tout aussi bien.
    Je ne comprends pas non plus la phase de rinçage, une fois que tous tes constituants sont sortis c'est bon.

  6. A voir en vidéo sur Futura
  7. #5
    hplc-valesp

    Re : HPLC - temps de rétention

    Merci beaucoup pour vos réponses!
    Je me penche sur le problème de nouveau aujourd'hui.
    Ce que j'appelais phase de rinçage, c'est en fait une phase à 100% de phase organique en fin de run. Je ne sais pas si c'est le bon terme!?
    Je la fais pour être certain que tout soit sorti justement (conseil de chef, discutable certes!!)
    En ce qui concerne la chromatographie ionique, pourquoi pas merci du conseil.

  8. #6
    rododu27

    Re : HPLC - temps de rétention

    En effet, il est tout de même préférable de faire une phase de rinçage étant donné que les colonnes sont réutilisés plusieurs fois, il vaut mieux être sur que tout est sortis

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