probleme avec ma PCR

[invite56b7fcda]

Salut.
Je dispose d'ADN dans lequel je dois amplifier un gene particulier. Disons A. Apres plusieurs PCR je n'ai aucun resultat. Alors que quand je transfert cet ADN sur membrane et que je fais une hybridation, j'ai des signaux. Ma sonde est le gene que je cherche mais amplifie avec un control positif.
Si j'ai des signaux apres hybridation,c'est que dans mon ADN il ya une sequence homologue au gene A. Mais pourkoi avec la PCR je n'arrive pas a amplifier. Mon ADN est pur et l'amorce fonctionne bien puisqu'elle amplifie bien avec le control positif.
Si vous avez des solutions pour moi ce sera vraiment super.
Merci.
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[invite9e1fd470]

Bonjour,

pleins de facteurs entre en compte. Tu met combien de copies d'ADN ou ta masse d'ADN dans ta PCR ????

[invite56b7fcda]

Bravo pour la rapidite de la reponse.
J'ai un ADN d'environ 400ng/ul. Et je fais des gammes de dilution avant PCR.J'ai une concentration finale d'environ 40ng/ul apres dilution.

[invite9e1fd470]

et en terme de nombre de copies ta calculé combien sa t'en faisait ?

C'est de l'ADN génomique, un plasmide c'est quoi ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite56b7fcda]

Je travaille avec de l'ADN genomique, et j'ai pas le nombre de copies desolee. C'est aussi important de savoir le nombre de copies?

[invite9e1fd470]

Ba si y en a pas assez tu peux avoir une amplification mais tu le vera pas sur le gel. En plus si c'est de l'ADN génomique, ta concentration est élevé mais ton nombre de copie beaucoup moindre. Et inversement, petit fragment avec concentration identique, sa fait beaucoup de copies ... Tu est à combien en MgCl2 ?

[invitef08e6467]

Et beh c'est plutôt vaste comme question... Plusieurs choses d'abord tes primers sont ils fiables...
Ensuite tu peux ajuster ta PCR : nb de cycles, faire un gradient de temperature pour l'hybridation, augmenter ou diminuer le temps d'élongation en fonction de la taille de ton fragment à amplifier, modifier ton tampon de reaction...

Tu peux aussi changer ton kit (si tu utilise un kit), la taq peut etre dégradée (agitation, decongélation...), les DNTp ou autre...

PS : si c'est un probleme de quantité tu pourras envisager une PCR sur ton produit PCR ou une nested PCR (second jeu de primers à l'interieur du produit pcr.

[invite56b7fcda]

J'utilise un buffer fait maison qui contient 20mM de Mgcl2. Mais j'en rajoute pas pour ma PCR. Et j'utilise 2.5ul de buffer pour un volume final de 25ul pour la PCR.

[invite9e1fd470]

Julilou, une PCR utilisant les produits d'une 1ère PCR et une PCR niché (nested PCR) c'est la même chôse.

Pour une PCR il faut du 1,5mM de MgCl2 si je me trompe pas. En général il n'y a pas de problème avec les kit (sauf si ta vraiment pas de bol), les dNTPS c'est vrai que congélation décongélation (ainsi que le taq) sa peut l'abimer mais la taq du commerce est de bonne qualité donc sa m'étonnerais. Je penserais plus à ta quantité d'ADN là, ou MgCl2

[invite56b7fcda]

merci pour tout ces conseils. Vous serez les premiers informes si j'ai mon amplification.See you