Determiner le nombre de fonctions Thiols

[invite0b1bbcd6]

Bonjour bonjour,
Je suis en licence de Biochimie et l'autre jour en TP j'ai réalisé un dosage afin de déterminer le nombre de fonctions thiols de l'ovalbumine. Pour ce faire j'ai :
- réaliser une cinétique de dénaturation avec différents temps de contact de l'urée sur la protéine (tube contenant : 0.5mL de DNTB à 0.01M + 2.5mL d'urée à 9M + 2mL de solution mère d'ovalbumine à 5.10^-5M) Grâce aux absorbances obtenues j'ai tracé la courbe Absorbance = f(temps) et je pense pouvoir déterminer l'absorbance de dénaturation totale (0.664)
-j'ai également réaliser une détermination du coefficient d'extinction molaire du NTB grâce à une gamme d'étalonnage : je trouve E=13670mol^-1.L.cm^-1
Arrive enfin la fameuse question : "déterminer le nombre de fonctions thiols accessibles au réctifs d'Ellman par molécule d'ovalbumine native, après dénaturation"
Et là, je ne vois pas trop comment faire, je calcule la concentration en NTB grâce à l'absorbance (0.664) et au coeff. d'extinction molaire (C=Abs/E = 4.86.10_-5M) mais je ne sais pas si cette concentration est pour 5mL ou pour 0.5mL... Je pense qu'il faut calculer le nombre de mol de NTB (qui sera égal au nombre de mol de fonction -SH car le réactif réagit mole à mole) puis faire le rapport de ce nombre de mole sur celui de l'ovalbumine
Le problème c'est que je ne sais pas quel volume utiliser et si je dois prendre en compte ou non des dilutions. J'ai trouvé pleins de résultats différents (0.605; 24.2; 4.11 etc...)
Donc si vous avez des conseils à me donner ou une piste pour le calcul je vous remercie d'avance !

Toucan-toco


Rien n'est plus proche du vrai que le faux
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[inviteee36c264]

Bonjour, je réalise le même TP que vous et je suis également bloqué au même stade ! J'ai déterminer le coefficient d'extinction molaire (13953 L.m.cm) et j'ai compris qu'il fallait que je transforme les absorbance en concentration grâce au coefficient, seulement je ne sais pas par quoi divisé..
Pouvez vous m'aider
Cordialement

[HarleyApril]

Bonjour

L'absorbance est proportionnelle à la concentration. Il te suffit de faire une règle de trois.
Tu as déterminé le coef d'extinction molaire par une mesure d'absorbance A à une concentration donnée c.
Avec l'ovalbumine, tu arrives à une absorbance mesurée A' qui correspond à une concentration inconnue c'.
Vu qu'il y a proportionalité, tu as A/A'=c/c'

Cordialement

[invitef63db823]

Bonjour, ayant actuellement le même TP je voulais savoir si vous aviez abouti, parce que je n'arrive pas à déterminer le nombre de fonctions thiols

[A voir en vidéo sur Futura]

[HarleyApril]

Pour faire plus simple à comprendre, on va raisonner en moles au lieu de concentration.
À partir de l'absorbance, tu trouves combien il y a de résidus nitrophényle qui se sont accrochés sur les thiols.
Comme tu sais combien il y a d'ovalbumine, tu sais combien il y a de nitrophényle (et donc de thiol) par ovalbumine.

Cordialement