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Dosage



  1. #1
    smack44

    Red face Dosage


    ------

    Bonjour,

    J'ai besoin de votre aide pour mieux comprendre ma prochaine manipulation.
    Je vous joins quelques éléments ci-dessous pour mieux comprendre le sujet.

    Dosage.docx


    Je ne vois pas quel principe de dosage nous allons utiliser ? qui pourrait m'expliquer la manipulation et surtout la technique que nous allons devoir utiliser?

    En vous remerciant par avance

    -----
    Fichiers attachés Fichiers attachés

  2. #2
    HarleyApril
    Modérateur

    Re : Dosage

    Bonsoir

    Merci de ne pas mettre ce genre de pièce jointe (risque de virus).
    Note qu'il est dit que pour le principe du dosage, il faut se référer au mode opératoire.
    Comme tu ne nous le communiques pas, il ne nous est pas possible de répondre !

    Bonne continuation

  3. #3
    moco

    Re : Dosage

    Il manque quatre informations pour que nous puissions répondre :
    1 - Qu'est-ce que la molécule INT ?
    2 - Le mode opératoire n'est pas indiqué (comme le relève Harley April) !
    3 - Quel est le "kit" dont il faut préparer les solutions ?
    4 - QU'est-ce que signifie ... l'échantillon pour le dosage ? De quel dosage s'agit-il ?

  4. #4
    smack44

    Re : Dosage

    Bonjour,

    J'ai bien pris note de ne plus insérer de pièce jointe.
    Voici le mode opératoire : https://www.azmax.co.jp/science/wp-c...35_2013-03.pdf

    D'après le mode opératoire je dirai que le principe de L'acide L-glutamique (L-glutamate) qu'il est désaminé par oxydation par le nicotinamideadénine dinucléotide (NAD) en 2-oxoglutarate en présence de l'enzyme glutamate déshydrogénase (GIDH).
    Dans la réaction catalysée par la diaphorase, le NADH formé se transforme en chlorure d'iodonitrotetrazolium (INT) et en un formazan dont le maximum est mesuré dans le domaine visible à492nm à 49°C.

    L'équilibre de la réaction se situe du côté du L-glutamate. En piégeant le NADH formé avec l'INT, l'équilibre est déplacé en faveur du 2-oxoglutarate.

    Si quelqu'un peut me confirmer qu'il s'agit bien du principe.

  5. A voir en vidéo sur Futura
  6. #5
    gts2

    Re : Dosage

    Bonjour,

    A priori la documentation indique clairement non seulement la manipulation mais aussi le principe.
    Il s'agit donc essentiellement de traduction.
    Le NADH formé ne se transforme pas en INT mais réagit avec.
    Le NADH ne se transforme pas non plus en formazan mais en NAD+, c'est l'INT qui se transforme en formazan.
    "the NADH formed converts iodonitrotetrazolium chloride (INT) to a formazan"=Le NADH formé convertit INT en formazan.
    Et peut-être aussi de synthèse : c'est un dosage indirect (on mesure la concentration d'un produit d'une réaction de l'espèce d'intérêt) par mesure du coeff. d'absorption.
    Il faudrait peut-être aussi lire un peu plus loin : passage de A à c : il y a la méthode classique (avec une gamme d'étalonnage) ce qui n'est pas le cas ici, il faut donc indiquer la méthode.

  7. #6
    smack44

    Re : Dosage

    Merci pour ce retour, justement je n'arrive pas à trouver cette méthode j'ai réalisé l'expérience mais je dois dire que j'ai juste suivi le protocole et effectivement je n'ai pas réalisé d'étalonnage.

  8. #7
    gts2

    Re : Dosage

    Dans le texte il est indiqué deux méthodes l'une utilisant le coefficient d'extinction, l'autre une solution de référence ; laquelle avez-vous utilisée ?

    D'autre part il y a un double blanc
    - échantillon - blanc classique : le ΔA
    - après réaction - avant réaction : A2-A1

  9. #8
    smack44

    Re : Dosage

    J'ai utilisé la méthode de la solution de référence et ensuite voilà ce que j'ai fait

    Le blanc est constitué de 0,600 mL de la solution 1; 0,200 mL de la solution 2; 0,200 mL de la solution 3 + 2000 mL d'eau

    L'essai est constitué de 0,600 mL de la solution 1; 0,200 mL de la solution 2; 0,200 mL de la solution 3 + 1800 mL d'eau avec 0,2ml de la solution inconnue

    Le controle est constitué de 0,600 mL de la solution 1; 0,200 mL de la solution 2; 0,200 mL de la solution 3 + 1800 mL d'eau avec 0,2ml de la solution 5

    Absorbances :

    1er essai : le blanc A= 0,057
    Essai A = 0,052
    Contrôle A = 0,054

    2 essai le blanc A= 0,099
    Essai A = 0,598
    Contrôle A = 0,663

  10. #9
    gts2

    Re : Dosage

    Toutes les méthodes repose sur la loi de Beer-Lambert , le tout étant de se débarrasser de
    La méthode classique repose sur une régression linéaire A=kc, la régression déterminant k.
    La votre s'appuie sur une concentration connue et fait le rapport entre les deux mesures
    Le A étant, bien sûr, le de manière à se débarrasser de toutes les perturbations

    Remarque sur les valeurs numériques : il doit y avoir des fautes de frappe A(échantillon)<A(blanc) pour le 1er essai.
    Dernière modification par gts2 ; 06/01/2023 à 08h11.

  11. #10
    smack44

    Re : Dosage

    Bonjour,

    Je reviens à la première question présenter le principe de cette méthode de dosage d’acide glutamique si je réponds ce qui suit pensez-vous que cela soit correct ?

    L'acide L-glutamique (L-glutamate) est désaminé par oxydation par le nicotinamide adénine dinucléotide (NAD) en 2-oxoglutarate en présence de l'enzyme glutamate déshydrogénase (GIDH).
    Dans la réaction catalysée par la diaphorase, le NADH formé réagit avec le INT (chlorure d'iodonitrotetrazolium). Le NADH se transforme NAD+ et l'INT en formazan qui est mesuré à son maximum dans le domaine du visible à 492nm.
    L'équilibre de la réaction se situe du côté du L-glutamate en piégeant le NADH formé avec INT l'équilibre est déplacé en faveur du 2 oxoglutarate.
    Il s'agit d'un dosage indirect par mesure du coefficient d'absorption.

    Je ne parle pas de la manipulation dans le principe nous sommes bien d'accord?

    Merci à vous

  12. #11
    gts2

    Re : Dosage

    On est d'accord.

    Citation Envoyé par smack44 Voir le message
    Dans la réaction catalysée par la diaphorase, le NADH formé réagit avec le INT (chlorure d'iodonitrotetrazolium). Le NADH se transforme NAD+ et l'INT en formazan qui est mesuré à son maximum dans le domaine du visible à 492nm.
    Peut-être allégé en "pour former NAD+ et formazan"

    Citation Envoyé par smack44 Voir le message
    L'équilibre de la réaction se situe du côté du L-glutamate en piégeant le NADH formé avec INT l'équilibre est déplacé en faveur du 2 oxoglutarate.
    Pour alléger de nouveau, "l'équilibre est déplacé dans le sens de la disparition du L-glutamate en éliminant le NADH formé par INT."

  13. #12
    smack44

    Re : Dosage

    Merci de votre retour, je continue si vous voulez bien me corriger à nouveau

    Présenter l'organigramme de la solution

    Identifier ce que contient chaque solution

    Solution 1 : 25mL de phosphate de potassium
    Solution 2 : 2,5 ml d'eau distillée + 35 mg de lyophilizate
    Solution 3 : 2,5 mL d'INT + 6 mL d'eau distillée + papier aluminium car INT est une molécule photosensible
    Solution 4 : 1,2 mL de glutamate

    Manipulation à réaliser par solution

    Solution 1 pas de manipulation particulière verser 25 mL de phosphate de potassium dans une fiole
    Solution 2 la fiole contient 35mg de hyophilizate nous avons rajouter 2,5ml d'eau distillée
    Solution 3 la fiole contient 2,5 mL d'INT puis on ajoute 6mL d'eau distillée
    Solution 4 la fiole contient 1,2 mL de glutamate

    Mode opératoire et Résultats sous forme de tableau (issu du protocole)

    Blanc Essai Contrôle
    Solution 1 0,600 0,600 0,600 Attendre 2 mn
    mL
    Solution 2 0,200 0,200 0,200
    mL
    Solution 3 0,200 0,200 0,200
    mL
    Solution 5 X X 0,2
    mL
    Solution inconnue x 0,2 X
    mL
    Eau 2000 1800 1800
    mL

    3 Expliquer la préparation de l'échantillon de l'échantillon pour le dosage




    4. Expliquer la préparation de la solution de contrôle :

    Pour préparer la solution de contrôle nous avons besoin de 0,600 mL de la solution 1 puis on ajoute 0,200 mL de la solution 2 ensuite on verse 0,200 ml de la solution 3, 0,2ml de la solution 5 et enfin 1800mL d'eau distillée.

    5. A partir de la loi de Beer Lambert démontrer la formule littérale permettant de calculer la concentration massique en g/l de l'échantillon et de la solution de contrôle puis réaliser l'application numérique. Calculer l'exactitude de la méthode pour la solution contrôle.

    Je pense reprendre la formule que vous m'avez indiqué dans le #9 seulement mes résultats ne semblent pas correctes car je n'ai pas fait d'erreur je viens de vérifier à nouveau.

  14. #13
    gts2

    Re : Dosage

    Pour 3 et 4 je ne comprends pas trop ce que veut dire "expliquer la préparation de la solution" sauf qu'à dire qu'on met un tampon pour avoir le bon pH pour la réaction, puis l'enzyme et NAD+ (la solution 2 contient aussi du NAD+), puis le réactif INT, puis l'enzyme pour la deuxième réaction réaction et à justifier les 2 mn d'attente et la prise de mesure 1.

    Pour 4, on fait rigoureusement la même chose que pour 3 de manière à pouvoir comparer l'échantillon et la référence.

    Vous n'avez pas à reprendre "ma formule" qui est la loi de Beer-Lambert, mais à démontrer la relation du texte à partir de Beer-Lambert.

    Il n'y peut-être pas d'erreur si ce que vous appelez l'essai 1 et 2 sont en fait les deux mesures initiales et finales.

  15. #14
    smack44

    Re : Dosage

    De mémoire nous n'avons pas utilisé de tampon pour la réaction.

    La justification des 2mn d'attente : un temps d'attente d'environ 2mn est nécessaire pour le développement de la couleur et la fin de la réaction puis j'ai mis ma prise de mesure 1 (blanc + l'essai + contrôle) dans le spectrophotomètre. On obtient 3 valeurs 1er essai : le blanc A= 0,057 Essai A = 0,052 Contrôle A = 0,054.

    On ajoute la solution 5 dans le blanc, l'essai et dans le contrôle on attend 20 mn pour voir apparaitre la couleur jaune (fin de la réaction) dans le noir puis mesure de l'absorbance du 2eme essai soit le blanc A= 0,099 Essai A = 0,598 Contrôle A = 0,663 .

    Pour la question 5

    Si j'ai compris on part de la loi de Beer-Lambert classique pour aboutir à c = (V × MW× / ε × d × v × 1000) × A [g/l]
    Je suis incapable de démontrer comment de la loi de Beer-lambert on aboutit à une telle formule?

    Le calcul numérique je reprends les données c =(3.030 × 147.13 /19.9 × 1.00 × 0.200 × 1000) X delta A x facteur de dilution =0.1120 X delta A

    Le delta A = (A2-A1) pour l'essai et (A2-A1)pour l'échantillon

    A= (0,598-0,052) - (0,099-0,057)= 0,504

    c =(3.030 × 147.13 /19.9 × 1.00 × 0.200 × 1000) X 0,504 =0.1120 X 0,504 = 0,056448 x facteur de dilution au 20ème = 1,12896

  16. #15
    gts2

    Re : Dosage

    Citation Envoyé par smack44 Voir le message
    De mémoire nous n'avons pas utilisé de tampon pour la réaction.
    "1. Bottle 1 with approx. 25 ml solution, consisting of: potassium phosphate/triethanolamine buffer, pH approx. 8.6;"

    Citation Envoyé par smack44 Voir le message
    Si j'ai compris on part de la loi de Beer-Lambert classique pour aboutir à c = (V × MW× / ε × d × v × 1000) × A [g/l]
    Je suis incapable de démontrer comment de la loi de Beer-lambert on aboutit à une telle formule ?
    Le V/v est le facteur de dilution, le MW le passage molaire/massique et le 1000 un problème d'unité lié à ε donné en mmol (la technique consistant à mélanger expression littérale et conversion d'unités baroques n'aide pas à comprendre, je le concède).

    Votre calcul numérique a l'air cohérent.

  17. #16
    smack44

    Re : Dosage

    La solution tampon a été au préalable préparée par les préparatrices le piège!

    Je reviens à la question 2 Identifier ce que contient chaque solution dois-je rajouter le NAD+ dans la solution 2

    Solution 1 : 25mL de phosphate de potassium
    Solution 2 : 2,5 ml d'eau distillée + 35 mg de lyophilizate
    Solution 3 : 2,5 mL d'INT + 6 mL d'eau distillée + papier aluminium car INT est une molécule photosensible
    Solution 4 : 1,2 mL de glutamate

    Manipulation à réaliser par solution dois-je rajouter le NAD+ dans la solution 2

    Solution 1 pas de manipulation particulière verser 25 mL de phosphate de potassium dans une fiole
    Solution 2 la fiole contient 35mg de hyophilizate nous avons rajouter 2,5ml d'eau distillée
    Solution 3 la fiole contient 2,5 mL d'INT puis on ajoute 6mL d'eau distillée
    Solution 4 la fiole contient 1,2 mL de glutamate

  18. #17
    gts2

    Re : Dosage

    Citation Envoyé par smack44 Voir le message
    Je reviens à la question 2 Identifier ce que contient chaque solution dois-je rajouter le NAD+ dans la solution 2
    "2. Three bottles 2 with each approx. 35 mg of lyophilizate, consisting of: diaphorase, approx. 4 U; NAD, approx. 28 mg"

  19. #18
    smack44

    Re : Dosage

    Merci

    3 Expliquer la préparation de l'échantillon pour le dosage

    J'ai calculé la masse pour préparer l'échantillon pour le dosage

    m=C X V
    g = g/L X L
    m= 1,3 X 0,2 X 10-3
    m= 2,6 x 10-4g

    F=20/40= 0,5 mL

    Je viens de calculer l'exactitude de la méthode pour la solution contrôle

    1,3 - 1,12896/1,3 = 13,15%

    la méthode est exacte si elle possède une exactitude inférieure à 5%! j'ai dû me planter quelque part lors de la manip

  20. #19
    gts2

    Re : Dosage

    La valeur 1,12896 ne concerne pas le contrôle mais votre échantillon.
    Avec votre contrôle, on trouve 1,27 si on applique une dilution de 20 mais le texte dit "Use the assay control solution undiluted."
    Dernière modification par gts2 ; 07/01/2023 à 18h56.

  21. #20
    smack44

    Re : Dosage

    j'avoue ne plus comprendre quel calcul je dois faire pour trouver le controle

  22. #21
    gts2

    Re : Dosage

    Pour trouver le contrôle, il faut utiliser les absorbances mesurées pour le contrôle et comparer à la concentration de la solution de contrôle ("Concentration: see bottle label").
    Pour trouver votre inconnue, il faut utiliser les absorbances mesurées pour l'inconnue.
    Dernière modification par gts2 ; 07/01/2023 à 19h06.

  23. #22
    smack44

    Re : Dosage

    Le delta A = (A2-A1) controle et (A2-A1)blanc

    A= (0,663-0,054) - (0,099-0,057)= 0,567

    c =(3.030 × 147.13 /19.9 × 1.00 × 0.200 × 1000) X 0,504 =0.1120 X 0,567 = 0,06 x facteur de dilution au 20ème = 1,27


    Exactitude de la méthode

    (0,071- 1,27/1,27)x 100 = -92,9%

    Je ne comprends pas le résultat!!!

  24. #23
    gts2

    Re : Dosage

    Citation Envoyé par smack44 Voir le message
    0,06 x facteur de dilution au 20ème = 1,27
    D'où sortez-vous ce facteur de dilution : de nouveau "Use the assay control solution undiluted."

  25. #24
    smack44

    Re : Dosage

    Effectivement

    Le delta A = (A2-A1) controle et (A2-A1)blanc

    A= (0,663-0,054) - (0,099-0,057)= 0,567

    c =(3.030 × 147.13 /19.9 × 1.00 × 0.200 × 1000) X 0,504 =0.1120 X 0,567 = 0,063504


    Exactitude de la méthode

    (0,071- 0,063504/0,063504)x 100 = 11,80%

    Toujours pas bon + de 5%

  26. #25
    gts2

    Re : Dosage

    Ce n'est pas bon, mais le calcul est correct. Après où est le problème justifiant les 10% ? Il aurait fallu être sur place.

  27. #26
    smack44

    Re : Dosage

    Vous avez raison peut-être que je peux modifier mon absorbance contrôle

  28. #27
    gts2

    Re : Dosage

    Citation Envoyé par smack44 Voir le message
    Vous avez raison peut-être que je peux modifier mon absorbance contrôle
    Ah non : on ne modifie pas une mesure !

  29. #28
    smack44

    Re : Dosage

    Non je sais je ne peux pas modifier mes données ma préparation a été mal réalisée.
    Comment puis-je conclure, un manque de précision dans la préparation des solutions 1-2-3-5 où peut-être que l'INT, qui est une molécule photosensible,n'a pas été suffisamment recouvert de papier aluminium.
    Enfin, est-ce que je peux présenter un résultat avec une absorbance différente A2 contrôle 0,703 au lieu de 0,663 et qui permettrait d'être en dessous de 5%?

    Un grand merci pour votre aide

    Bon après-midi

  30. #29
    gts2

    Re : Dosage

    Citation Envoyé par smack44 Voir le message
    Comment puis-je conclure, un manque de précision dans la préparation des solutions 1-2-3-5 où peut-être que l'INT, qui est une molécule photosensible, n'a pas été suffisamment recouvert de papier aluminium.
    Oui, c'est cela la bonne idée, trouver une explication raisonnable de l'écart.

    Citation Envoyé par smack44 Voir le message
    Enfin, est-ce que je peux présenter un résultat avec une absorbance différente A2 contrôle 0,703 au lieu de 0,663 et qui permettrait d'être en dessous de 5% ?
    Pour moi, cela s'appelle de la triche ...

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