Cinétique à deux substrats et allosterie

[smack44]

Bonjour,

J'ai besoin de votre aide afin de comprendre les résultats que je trouve pour cet exercice.
Le tableau suivant donne els mesures de la vitesse initiale (en unités arbitraires) obtenures en l'absence et en présence de thréonine à une concentration de 40µmol/L. Ci dessous vous trouverez le tableau avec les données.

Je dois représenter les courbes vi=f([S]) en l'absence et en présence de thréonine et conclure (ci-dessous mes courbes)
J'envisage de conclure en disant : que la thréonine agit comme un inhibiteur de l'aspartikinase I en ralentissant la réaction enzymatique. elle régule négativement l'activité de l'aspartikinase I dans la voie de la biosynthèse des acides aminés.
Tableau des données.png
Cinétique a deux substrats et allosterie.xlsx

Je dois ensuite effectuer la représentation en double inverse en l'absence de thréonine voir graphique ci-dessus et je dois en déduire la constante de michaelis et celle de la vitesse maximale.
J'ai utilisé la droite d'équation étant donné que ma droite ne passe ni par l'axe des abscisses ni celle des ordonnées, je ne peux donc trouver graphiquement le Km et le Vmax.

J'ai considéré Y=aX+b et a= Km/Vmax 1000 Vi max /2 = 500 1/Vmax soit 1/500 =0,002 Vmax = 0,002 mol/L j'aurai pu prendre le b de mon équation plus juste soit 517,52

ensuite Km=520,53 x Vmax
km= 520,53 x 0,002= 1,041106 soit 1,04 mol/L

Pourriez-vous me donner SVP votre avis et m'apporter des explications si ma méthode est incorrecte?
Bon après-midi
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[gts2]

ma droite ne passe ni par l'axe des abscisses ni celle des ordonnées, je ne peux donc trouver graphiquement le Km et le Vmax.

?!? La droite coupe l'axe des ordonnées en 1 à peu près donc Vmax de l'ordre de 1 mmol/L et coupe l'axe des abscisses en -0,5 soit K de l'ordre de 2 cohérent avec le calcul qui donne 1 et 1,93

[smack44]

Sur ma représentation en double inverse cela ne se vérifie pas, la droite est complètement fausse. Est-ce que vous voyez dans le fichier excel joint les 2 courbes et la droite?
Techniquement comment je peux sous excel continuer l'axe des abscisses et des ordonnées et prolonger la droite.

[gts2]

Cela marche pour le cas sans thréonine : c'est bien ce que vous dites : "Je dois ensuite effectuer la représentation en double inverse en l'absence de thréonine."

Dans le cas avec, manifestement la modélisation type Michaelis ne convient pas. On voit par contre que la limite est la même. On doit pouvoir conclure, mais cela sort un peu de mes compétences.

En parlant de compétence, mes compétences sous Excel sont insuffisantes pour répondre à la question, peut-être sur un forum informatique.
Ceci étant vous avez la droite, b vous donne 1/Vmax et a K/Vmax, vous devez pouvoir en déduire K et Vmax.

[A voir en vidéo sur Futura]

[gts2]

J'ai l'impression que vous avez interverti l'abscisse et l'ordonnée :

[smack44]

Je viens de faire la représentation en double inverse en l'absence de thréonine sur papier millimétré et je trouve :
1/Vmax = 1 donc Vmax= 1 mol/L je ne suis pas certaine les unités de [S] sont en mol/L
-1/Km=-500 soit 2 x 10-3
L'énoncé donne les mesures de la vitesse initiale (en unités arbitraires) obtenues en l'absence et en présence de thréonine à une concentration de 40µmol/L.
Il faut maintenant que je fasse la représentation de HILL en présence et en absence de thréonine et comparer les résultats avec la constante de michaelis ainsi que l'indice de coopérativité n en présence de thréonine. Je vais aller fouiller sur internet où peut-être vous allez pouvoir m'aiguiller ?

[smack44]

Effectivement sur excel je mettais trompée entre l'axe des abscisses et ordonnées. J'ai corrigé mon erreur sur papier millimétré

[gts2]

Vos valeurs sont correctes cette fois. (Mes valeurs ont été obtenues avec des mmol/L).

Pour Hill c'est la même chose sauf qu'il faut remplacer S par Sⁿ (enfin je crois ...).
Si vous tenez à linéariser (représentation de Hill ?), la courbe sera log(V/(Vmax-V)) (avec Vmax raisonnablement de 1) en fonction de log(S) qui donnera n log(S) - log(K)

[smack44]

je vous joins ma représentation de Hill mais je ne comprends pas les résultats que j'obtiens pourtant j'ai bien repris le Vmax obtenu à la question précédente.
Représentation de Hill.xlsx
Sachant que je dois effectuer la représentation de Hill Ln(Vi/Vmax-Vi)=f(Ln[S]) en l'absence et en présence de thréonine. En déduire la valeur de la constante de Michaélis ( à comparer avec celle obtenue précédémment) ainsi que l'indice de coopérativité n en présence de thréonine.

Je suis un peu perdue!

[gts2]

Vous n'avez pas tapé la bonne expression qui est et non

[smack44]

Bonsoir,

Je viens de modifier mes calculs, êtes-vous d'accord avec les courbes.Représentation de Hill.xlsx
Ensuite, il faut que je déduise la valeur de la constante de Michaelis (comparer celle obtenue avec la représentation en double inverse) ainsi que l'indice de coopérativité n en présence de thréonine.

[gts2]

Bonjour,

Vous avez calculé Vmax-Vi=2,66-Vi alors que Vmax vaut 1

Avec Vmax=1 on a bien une droite et comme ln(...)=n ln(S) + ln(K) vous avez immédiatement n et K avec la régression linéaire.

[smack44]

Bonjour,

Selon moi Vmax vaut 1 en l'absence de thréonine et 2,66 en présence de thréonine (j'ai du tracer la droite en représentation inverse pour trouver Vmax et KM en présence de thréonine).

J'ai tenté de calculer n et km en l'absence de thréonine pour voir si j'ai compris la méthode.
La pente de la droite de régression linéaire correspond à n. En prenant 2 points sur la droite je trouve -0,15.
Pour calculer Km=- ordonnée à l’origine/n
km =- 6,2/-0,15 = 41,3

Merci pour votre retour

[gts2]

Vmax vaut 1 en l'absence de thréonine et 2,66 en présence de thréonine (j'ai du tracer la droite en représentation inverse pour trouver Vmax et KM en présence de thréonine).

En double inverse les points s'éloignent fortement de la droite de régression, donc les paramètres de celle-ci ne sont pas pertinent.
Michaelis.png
Par contre si on trace la fonction de Hill, on voit bien que l'asymptote est 1.
Hill-non-lin.png

J'ai tenté de calculer n et km en l'absence de thréonine pour voir si j'ai compris la méthode.
Pour calculer Km=- ordonnée à l’origine/n

Pourquoi ? L'ordonnée à l'origine est -ln(K) d'après l'équation de Hill : en partant de , on obtient

J'ai tenté de calculer n et km en l'absence de thréonine pour voir si j'ai compris la méthode.
La pente de la droite de régression linéaire correspond à n. En prenant 2 points sur la droite je trouve -0,15.

Je trouve 1 (et si vous avez effectué la régression pas la peine de prendre deux points)
Sur la courbe (en gros) x varie de 0 à 3 alors que y varie de -0,5 à 2,5 donc 3/3=1
Hill-lin-sans.png

[smack44]

je ne trouve pas du tout la même droite mes résultats sont très certainement faux et j'aimerai comprendre.Représentation de Hill.xlsx
Ln[S] est négatif de mon côté ce qui ne semble pas être votre cas.

[smack44]

Je viens de comprendre vous êtes passé en mmol/L

[gts2]

Oui je suis bien passé en mmol pour éviter de taper les x10-3 ou les 0,00.

Votre courbe a bien une pente de 1 : en gros on va de -7 à -3,5 sur x (variation 3,5) et de -1 à 2,5 en x (variation 3,5) ce qui fait bien une pente de 1.
Pour la courbe avec, vous n'avez pas corrigé Vmax qui vaut 1.

[smack44]

Je viens de refaire les calculs en passant en mmol/L Représentation de Hill.xlsx

J'ai compris comment vous avez calculé le n =1 en l'absence de thréonine comme les 2 droites se coupent x varie de 0 à 3 et y varie de -0,5 à 2,5 donc 3/3=1
Donc n=1 en l'absence et en présence de thréonine.
pour trouver km en présence de thréonine. Je prends sur mon graphique la droite en présence de thréonine qui coupe l'axe des abscisses en 2,25 lnkm/n et je trouve un km =9,48 mmol/L
Est-ce que ma démarche est logique

[gts2]

Comment à partir de ln(K)/n=2,25 avec n=3 (c'est bien cela ?) avez-vous trouvé K=9,48 ? (je trouve de l'ordre de 1000)

[smack44]

Effectivement j'ai repris 1 pour n mais vous avez raison en présence de thréonine la pente est de 3 donc n=3
lnK/3=2,25 k=e puissance 6,75 je trouve 854 mol/L

[gts2]

Cela parait plus raisonnable.

[smack44]

Merci pour le temps consacré et votre aide, j'ai mieux compris.