PCR, amorces

[ggpessoa]

pourquoi le pourcentage en GC doit-il être de 50% pour de bonnes amorces pour la PCR ? Et pourquoi faut-il que le côté 5' soit riche en GC et pas le côté 3' ?

[nayeki]

Hello,

Il y a 3 liaisons hydrogènes entre G et C et seulement 2 entre A et T.
Cela influe sur la température d'"annealing" (connais pas le terme français )


Quant à la 2éme question, j'imagine que c'est mieux pour la phase d'élongation par la Taq

[Yoyo]

Correction, c'est le coté 3' qui doit etre GC riche (le mieux etant que l'amorce se termine par un ou plusieurs G ou C). Car la Taq n'amorcera la polymerisation que si l'amorce est parfaitement appariée en 3'.
En 5' ca n'a aucune importance, on peut meme y rajouter des bases totalement absentes de la matrice a amplifier (on rajoute frequemment des sites de restriction).

Yoyo

[ggpessoa]

merci pour vos réponses

ok mais pourquoi 50% ? Plus le GC% sera élevé, mieux ça sera ?

[gorben]

salut!

plus le GC% est elevé, plus la temperature d'hybridation (Th) est elevée et plus ta PCR est specifique. Avec 20° de Th, tes amorces vont se coller un peu partout sur l'ADN et tu risques d'amplifier n'importe quoi.

Pour calculer rapidement (plus ou moins justement) ta Th tu fais (nG+nC)*4 + (nA+nC)*2 et ca te donne la temperature en degré. En general, tu choisis des amorces de 20 pb et donc des amorces avec des Th de 60°C.

Tous les organismes ne te permettent pas de chosir des amorces avec 50%GC donc dans ce cas, pour augmenter la Th tu augmente la taille de ton amorce...

[nayeki]

Envoyé par gorben

salut!

plus le GC% est elevé, plus la temperature d'hybridation (Th) est elevée et plus ta PCR est specifique. Avec 20° de Th, tes amorces vont se coller un peu partout sur l'ADN et tu risques d'amplifier n'importe quoi.

Pour calculer rapidement (plus ou moins justement) ta Th tu fais (nG+nC)*4 + (nA+nC)*2 et ca te donne la temperature en degré. En general, tu choisis des amorces de 20 pb et donc des amorces avec des Th de 60°C.

Tous les organismes ne te permettent pas de chosir des amorces avec 50%GC donc dans ce cas, pour augmenter la Th tu augmente la taille de ton amorce...

Ce qui peut s'avérer être très risqué


Sinon la composition du tampon joue aussi pas mal (concentration en MgCl2, KCl, détergents etc...)